이 프로토콜을 사용하면 질병뿐만 아니라 건강에서도 각 세포 유형 반응을 특징 짓는 세포 간 칼슘 신호 패턴을 밝힐 수 있습니다. 이 기술은 복잡한 세포 행동의 빠르고 상세한 생물 물리학 적 특성을 가능하게합니다. 우리는 이 IgG 유도 칼슘 신호 전달을 신경염증 질환의 개인화된 의학을 위한 지문으로 사용할 계획입니다.
실제 환경에서는 모든 과정과 사건, 특히 현미경으로 일어나는 사건을보고 따라가는 것이 쉽지 않습니다. 따라서 시각적 데이터가 중요합니다. 생후 1-3 일 된 새끼를 참수 한 후 작은 각진 가위로 피부를 잘라 두개골을 노출시킵니다.
그런 다음 궤도를 향해 구멍 매그넘을 절단하여 두개골을 열고 수직 정중선 절단을합니다. 두개골에서 뇌를 제거하고 PBS가 들어있는 페트리 접시에 넣으십시오. 집게의 끝을 사용하여 두 반구 사이의 연결을 찢고 반구를 중앙에서 옆으로 부드럽게 밀어 구부러진 집게로 반구를 분리합니다.
직선 및 곡선 집게를 사용하여 수막을 조심스럽게 찢어 제거합니다. 그런 다음 구부러진 집게로 꼬집어 해마를 제거하고 버리거나 다른 세포 배양 준비에 사용하십시오. 다음으로, 피질을 3 밀리리터의 차가운 PBS가 들어있는 15 밀리리터 튜브로 옮기고 1 밀리리터 팁으로 10-15 회 위아래로 피펫팅하여 조직을 균질화합니다.
세포를 500g에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 버리고 1밀리리터 팁으로 피펫팅하여 3밀리리터의 차가운 PBS에 펠릿을 재현탁합니다. 다시 한 번 원심분리하고 10%FBS와 항생제가 보충된 완전한 DMEM 2ml에 펠릿을 재현탁합니다.
균질 액을 2 밀리리터 튜브로 옮긴 후, 균질 액을 21 및 23 게이지 바늘에 통과시켜 단일 세포의 현탁액을 만듭니다. 하나의 피질에서 준비된 세포 현탁액을 3 밀리리터의 완전한 DMEM이 들어있는 60 밀리미터의 페트리 접시에 붓고 페트리 접시를 가볍게 흔들어 현탁액이 균일하게 분포되도록합니다. 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소와 95 % 공기가있는 가습 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.
성상 세포 성장을 촉진하려면 오래된 배지를 제거하고 예열 된 PBS로 세포를 세척하여 느슨하게 부착 된 신경교 세포와 FBS의 흔적을 제거하면 70-80 % confluency에 도달합니다. 그런 다음 예열 된 트립신 용액 1 밀리리터를 추가하여 성상 세포의 밑에있는 층을 트립신 화하고 섭씨 37도에서 2-5 분 동안 배양합니다. 현미경을 사용하여 세포가 분리되기 시작하는지 확인하고 4밀리리터의 완전한 DMEM을 추가합니다.
세포 현탁액을 모아서 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 500g에서 5 분 동안 원심 분리하십시오. 상청액을 버리고 펠릿을 완전한 배지 1ml에 재현탁합니다.
혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. 다음으로, 배양 접시를 준비하고 배양 배지를 첨가한다. 세포를 5밀리리터의 새로운 완전한 DMEM에서 평방 센티미터당 10 내지 제4 세포의 밀도로 재플레이트하고, 각각의 배지 교체 전에 완전한 DMEM으로 세포를 세척한다.
70 내지 80% confluency에 도달한 후, 트립신 화를 반복하고, 7 밀리미터의 폴리-L-라이신-코팅된 원형 유리 커버 슬립에 제3 성상세포를 10회 5회 시드한다. 10분 동안 부착하고 완전한 DMEM을 추가합니다. 48 시간 후에 실험에 사용하십시오.
소교세포 배양을 준비한 후 미세아교세포를 촉진하기 위해 신경교세포가 합류하도록 하고 10-15일 후에 미세아교세포가 성상교세포 층 위에 나타납니다. 오비탈 셰이커에서 페트리 접시를 220RPM에서 2시간 동안 흔듭니다. 이제 1 밀리리터 피펫 팁으로 상청액을 흡인하여 분리되고 느슨하게 부착 된 세포를 가볍게 씻으십시오.
상청액을 세포 층에 여러 번 부드럽게 분배하여 이 세척 단계 동안 전체 세포층 표면을 덮도록 합니다. 분리 된 세포가있는 배지를 수집하여 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 원심분리하고, 재현탁하고, 앞에서 설명한 대로 세포를 계수합니다.
3차 미세아교세포에 10번 5번 시드하여 7-밀리미터의 폴리L-라이신이 코팅된 원형 유리 커버 슬립. 10분 동안 부착하고 완전한 DMEM을 추가합니다. 48 시간 후에 실험에 사용하십시오.
전체 DMEM을 씻어 내려면 하나의 커버 슬립을 세포 외 용액이 담긴 접시에 옮깁니다. 5 마이크로 몰의 최종 농도를 달성하기 위해 1 밀리몰 Fluo-4 AM을 세포 외 용액으로 희석하여 염료 로딩 용액을 준비하십시오. 세포와 함께 커버 슬립을 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 염색 로딩 용액에 넣고, 세포를 세포외 용액으로 20분 동안 세척한다.
커버 슬립을 1 밀리리터의 작업 용액으로 기록실에 놓습니다. 실험 전체에서 일관된 수의 셀을 갖는 시야를 선택합니다. 이미징을 시작하고 3-5분 동안 형광의 기본 수준을 획득하여 기준선을 결정합니다.
그런 다음 작업 용액의 흐름을 중지하고 원하는 시간 동안 테스트 용액으로 전환하십시오. 각 시험 용액 사이에서 3 분에서 5 분 동안 일정한 작업 용액의 흐름으로 세포를 씻으십시오. 용액 상단에서 일정한 흡입을 배열하여 기록 챔버의 용액 부피를 1 밀리리터로 유지하십시오.
신호 강도가 가장 높은 프레임을 선택하고 Polygonal 도구 응용 프로그램을 사용하여 하나의 셀을 둘러쌉니다. 획득한 필드의 모든 셀을 둘러싼 후 원 도구를 사용하여 배경에서 관심 영역 5개를 선택합니다. 그런 다음 단일 셀의 평균 신호 강도와 각 시간대의 배경을 측정합니다.
관심 있는 모든 영역을 선택하고 ImageJ의 ROI 관리자에서 다중 측정 명령을 사용하거나 상용 소프트웨어에서 이와 동등한 명령을 사용합니다. MATLAB 소프트웨어에서 데이터를 가져온 후 5개의 배경 ROI를 평균하고 동시에 획득한 프레임의 평균 ROI 강도에서 각 프레임의 평균 배경을 뺍니다. 나중에 칼슘 피크의 진폭, 과도 칼슘의 통합 변화, 피크까지의 시간, 상승 시간, 반폭 및 주파수를 결정하여 칼슘 활성을 분석합니다.
GFAP는 성상 세포를 시각화하고 Iba1을 시각화하여 미세 아교 세포를 시각화하는 데 사용됩니다. hSOD1G93A 성상 세포는 ALS 면역 글로불린 G에 반응하여 칼슘 과도 현상의 진폭이 더 크고, 전체적으로 더 상당한 통합 변화가 있으며, 비 형질 전환 성상 세포보다 피크까지의 시간이 짧습니다. ALS 면역 글로불린 G에 대한 반응은 ATP에 대한 반응과 구별 될 수 있습니다.
hSOD1G93A 성상 세포는 저장 고갈에 의해 밝혀진 바와 같이 저장소에서 더 높은 수준의 칼슘 이온을 가졌으며,이 이온의 과부하를 나타냅니다. 미세아교세포를 배양하고, 시간 경과에 따른 평균 형광 강도를 추출하였다. 3 개의 세포의 칼슘 흔적은 하나의 세포 만이 ALS 면역 글로불린 G에 반응하는 반면 모든 세포는 ATP에 반응한다는 것을 나타 냈습니다.
의사 컬러 이미지는 ALS, IgG 및 ATP에 대한 반응의 형광 강도 및 기준선을 나타냅니다. 세포는 적절하게 로드되어야 하고 이미징 시스템의 매개변수는 실험 중에 신호가 분리되지 않도록 적절하게 조정되어야 합니다. 칼슘 방출과 함께 패치 클램핑을 수행할 수 있습니다.
따라서, 상이한 막 이온 전류와 칼슘 방출 사이의 상관 관계에 대한보다 완전한 그림이 얻어 질 수있다. 세포 내 칼슘 항상성에 대한 이해는 스트레스가 많은 외부 자극뿐만 아니라 자연적 자극에 대한 여러 반응을 탐구하는 데 필수적입니다.
