연구는 세포 연구소와 Organismic 생물학에서 EM 코어와 학계 Sinica, 타이 페이, 대만의 곳을 알아내는-엠 코어에서 수행 했다. 작품은 학계 Sinica 및 대부분에 의해 지원 되었다.

1. 섹션 초파리 조직을 진동 블레이드 톰을 사용 하 여
<ol>
	<li>얼음에 초파리 를 anesthetize 하 고 인산 염 버퍼에 4% 낮은 녹는 agarose의 1 mL에 각 하나의 비행을 담가. 얼음에 공고히 agarose를 허용 합니다. 일반적으로, 4-6 파리 처리 되었습니다.</li>
	<li>진동 블레이드 톰을 사용 하 여 섹션 agarose 젤에 포함 된 초파리 조각 100 µ m 두께 2.5%도 0.1 M 인산 염 버퍼에 포함 된 통 솔루션에 몰두. 참고: 조직 아키텍처 다른 방법에 비해 더 그대로 남아 있기 때문에 선호는 Vibratome 단면입니다. 또는, 핀셋을 해 부 2.5%도 0.1 M 인산 염 버퍼에 포함 된 통 솔루션으로 IFM을 해 부를 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>
2. 준비는 고압 및 동결 대체 (HPF/FS) 방법으로 EM 표본
<ol>
	<li>인산 염 버퍼, 2 방울 (~ 100 µ L) 20 %BSA 인산 염 버퍼의 다음의 3 방울 (~ 150 µ L)에서 조직 단면도 씻어. 다음 HPF 버퍼 및 20 %BSA 가득에 대 한 금 사업자에 섹션을 배치 합니다.</li>
	<li>사용자 설명서에 따라 고압 냉동 고에 운반대를 포함 하는 샘플을 로드 합니다.</li>
	<li>동결, 후 액체 질소 아래 홀더 사업자 놓고-140 ° c 냉각 동결 대체 장치에 전송</li>
	<li>표 1, 2%도, 2% 오스뮴 tetroxide 그리고 아세톤에 0.1 %uranyl 아세테이트 칵테일 fs와 같이 동결 대체 프로토콜을 수행 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 바늘으로는 표본 캐리어에서 제거 하 고 실 온에서 수 지에 견본을 포함. 16 h 65 ° C에서 수 지 유해 참고: FS 프로토콜 샘플의 준비를 수정 해야 합니다. HPF/FS는 열 대권 외의를 유지 하 고 세포 내용의 손실을 최소화를 선호 된다.<ol>
		<li>양자 택일로, 화학 기정 프로토콜을 적용 됩니다. 표본 2.5%도 함께 하룻밤, 버퍼와 세척 고 1% 오스뮴 tetroxide 2 h. 세척에 대 한 해결 및 에탄올의 농도 오름차순으로 탈수와 다음 침투 고치고 16 65 ° C에서 polymerizing 전에 Spurr의 수 지에 견본을 포함 h입니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 전자 단층 촬영에 대 한 직렬-섹션은 견본의 준비
<ol>
	<li>조직에 있는 원하는 블록 얼굴 노출 견본 블록을 잘라.</li>
	<li>금 입자를 pretreat (10 nm 직경에서) 30 분 세척에 대 한 1 %BSA PBS 버퍼에 금 입자를 일시 중단 하 고. 표준 마커를 만드는 탄소 필름으로 코팅 된 구리 슬롯 격자에 금 입자를 오버레이 합니다.</li>
	<li>단층 촬영 수집의 보기의 필드에 충분 한 표준 마커 (마커 적어도 5-10)를 가장 아래에서 확인.</li>
	<li>두께 ultramicrotome를 사용 하 여 200-250 nm 직렬 섹션을 잘라.</li>
	<li>슬롯 격자 얇은 섹션에 대 한 완벽 한 루프를 사용 하 여에 직렬 섹션을 수집 합니다.</li>
	<li>10 분 동안 Reynold의 리드 시트르산과 섹션 얼룩.</li>
	<li>섹션 상단 표준 금 입자의 두 번째 레이어를 오버레이 합니다.</li>
</ol>
4. 수집 이중 기울기 전자 단층 촬영
<ol>
	<li>이중 축 단층 촬영 홀더에 그리드를 로드 하 고 200에서 전송 전자 현미경에 삽입 kV.</li>
	<li>Eucentric 초점에 현미경을 맞춥니다.</li>
	<li>자동 데이터 수집 소프트웨어를 설정 합니다. 조정 하 고 다중 스케일 영상 설정에서 전자 빔 정렬. 작업 세부10 (그림 2)에 대 한 사용자 설명서를 참조 하십시오.</li>
	<li>단층 촬영 컬렉션 설정에서 탄소 필름 없이 빈 영역에 카메라 어둡고 밝은 참조를 취득 합니다.</li>
	<li>낮은 확대율에서 격자 아틀라스를 수집 합니다. 단층 촬영 컬렉션의 대상으로 직렬 섹션에 미토 콘 드리 아를 선택 합니다.</li>
	<li>에 2 ° 증가와 60 °-60 °에서 기울기 시리즈를 취득 축-A 각 대상에 대 한. 참고: 기울기 각도 기계적으로 제한 될 견본 홀더 디자인. 홀더는 높은 기울기 각도에서 빔을 차단 됩니다.</li>
	<li>두 번째 기울기 시리즈를 수집 하려면 견본 홀더 90 ° 회전 합니다. 새로운 지도 획득 합니다. 해당 위치를 선택 하 고 각 대상에 대 한 축-B에 기울기 시리즈를 취득. 참고: 다른 소프트웨어 패키지, SerialEM 및 Xplore3D, 자동 데이터 수집을 위해 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>
5. 3D Tomograms 재구성 및 세그먼트 하위 볼륨 소프트웨어를 사용 하 여
<ol>
	<li>아이 모드 소프트웨어11를 사용 하 여 이중 축 기울기 이미지의 tomograms를 재구성 합니다.
	<ol>
		<li>작업 세부 사항에 대 한 사용자 설명서를 참조 하십시오.</li>
		<li>골드 표준 마커의 위치에 의해 개별 기울기 시리즈를 맞춥니다. 모두 축 A에 다시 투영 메서드 또는 동시 반복적 재구성 기법 (SIRT) 메서드에서 tomograms를 재구성 및 축-B, 각각 (그림 3).</li>
		<li>축-A의 tomograms 결합 축-b 감소 누락 쐐기 유물와 이중 기울기 tomogram 생성 하.</li>
		<li>전체 mitochondrion 볼륨을 취재 하는 개조를 직렬 섹션의 더블-틸트 tomograms 함께 가입. 모델 아이 모드 프로그램에 의해 직렬 섹션 사이의 간격.</li>
		<li>결합 된 tomograms 및 빈 볼륨 세분화에 대 한 원하는 크기 트림.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>조인 된 직렬 tomograms 3D 소프트웨어를 사용 하 여 분석 합니다.
	<ol>
		<li>작업 세부 사항에 대 한 사용자 설명서를 참조 하십시오.</li>
		<li>필터링 기능 대비 개선 하 고 배경 밀도 줄일 가우스 필터 (또는 다른 방법) tomograms.</li>
		<li>수동 또는 자동으로 미토 콘 드리 아의 열 대권 외 세그먼트.</li>
		<li>3d에서 검사 수 있도록 세분화 모델을 표시 합니다.</li>
		<li>3D에서 사용할 수 있는 도구를 사용 하 여 영화를 생성 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dahl, R., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+freezing+for+the+preservation+of+biological+structure:+theory+and+practice.">High-pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice.</a> J Electron Microsc Tech. 13 (3), 165-174 (1989).</li><li>Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemistry+and+electron+microscopy.+The+preservation+of+cellular+ultrastructure+and+enzymatic+activity+by+aldehyde+fixation.">Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation.</a> J Cell Biol. 17, 19-58 (1963).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography.">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 172 (2), 169-179 (2010).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).</li><li>Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+by+electron+tomography:+from+cells+to+molecules.">Structural studies by electron tomography: from cells to molecules.</a> Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).</li><li>Soto, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+electron+tomography:+a+method+for+three-dimensional+reconstruction+of+large+structures.">Serial section electron tomography: a method for three-dimensional reconstruction of large structures.</a> Neuroimage. 1 (3), 230-243 (1994).</li><li>Jiang, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomographic+analysis+reveals+ultrastructural+features+of+mitochondrial+cristae+architecture+which+reflect+energetic+state+and+aging.">Electron tomographic analysis reveals ultrastructural features of mitochondrial cristae architecture which reflect energetic state and aging.</a> SciRep. 7, 45474 (2017).</li><li>Cogliati, S., Enriquez, J. A., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Cristae:+Where+Beauty+Meets+Functionality.">Mitochondrial Cristae: Where Beauty Meets Functionality.</a> TrendsBiochemSci. 41 (3), 261-273 (2016).</li><li>Friedman, J. R., Nunnari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+form+and+function.">Mitochondrial form and function.</a> Nature. 505 (7483), 335-343 (2014).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated,+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon.">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J Struct Biol. 167 (1), 11-18 (2009).</li><li>Mastronarde, D. N., Held, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tilt+series+alignment+and+tomographic+reconstruction+in+IMOD.">Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD.</a> J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이 프로토콜에서 우리는 직렬 섹션 전자 단층 촬영 3D 미토 콘 드 리아 열 대권 외의 초파리 간접 비행 근육의 연구에 적용 하기 위한 최적화 된 워크플로 설명 합니다. 샘플에서 열 대권 외의 보존은 분석의이 유형에 대 한 기본 기술 도전 이다. 위해 최고의 열 대권 외의 두 방법론 단계 포함 되었습니다. 첫째, 조직 조직 아키텍처를 가능한 한 많이 유지 블레이드 톰을 진동으로 단면에 의해 샘플링 되었다. 둘째, HPF/FS 프로토콜 포함된 견본 블록의 준비 하는 동안 세포 기관이 열 대권 외의를 유지 하기 위해 최적화 되었다. 표본 높은 압력, 물의 어는 점을 손상 열 대권 외1얼음 결정의 형성을 감소 시킨다는 동결 했다. 표본으로 0.1 m m 두께 즉시 vitrified 고 EM 분석을 위한 견본 블록을 생성 하는 대체 동결 대상이 될 수 있습니다. HPF/FS로 열 대권 외의 향상 된 보존, 화학 고정 방법에 비해 지적 했다. 이 일련의 단계를 사용 하 여 샘플 준비, 미토 콘 드 리아 이중 막과 cristae 막의 보존 극적으로 개선 되었다.
시료의 직렬 섹션을 얻는 방법의 가장 어려운 단계입니다. 으로 전자 빔 침투 전력 제한, 섹션의 두께 어느 250 또는 500 nm 200에서 가장을 사용 하 여 k v 또는 300 kV, 각각. mitochondrion의 두께 이상의 2 µ m 일 수 있으므로 직렬 섹션 전체 볼륨 복원을 얻기 위해 필요 합니다. 그러나, 전체 세포 기관이 되도록 직렬 섹션의 충분 한 수를 복구 하는 것은 기술 도전 이다. 트리밍는 사다리꼴의 기초 사이 가능한 평면 수 블록 얼굴 슬롯 눈금 더 많은 부분을 수용 하 고 따라서 더 큰 볼륨을 커버 수 있습니다. 또한, 얇은 섹션에 대 한 완벽 한 루프를 사용 하 여 직렬 섹션 그리드 전송 성공률을 증가 합니다.
표준 안에 핵심 장비와 직렬 섹션 전자 단층 촬영을 수행할 수 있습니다. 그러나, 메서드는 기술적 제한에서 발생 하는 몇 가지 피할 수 없는 제한이 있습니다. 하나는 자료 직렬 섹션, 조인된 재건에 격차를 떠나 사이 필연적으로 손실입니다. 두 번째 달성 제한 기울기 각도 때문에 발생 하는 누락 된 쐐기 유물이 이다. 이 제한에는 견본 홀더 전자 빔 차단 하지 않고 전체 회전에 설정할 수 없습니다 때문에 발생 합니다. 이러한 제한에도 불구 하 고 직렬 섹션 전자 단층 세포와 세포 기관이 열 대권 외의 차원에서 공개를 충분 한 확인을 합니다.
작은 규모 이미징, cryo 전자 단층 촬영은 고분자 복합물 및 어셈블리에 현장에서 함께 하위 단층 또는 하위 angstrom 해상도 구조를 사용할 수 있는 신흥 기술 재건축3. 이 응용 프로그램에서 셀 단면 또는 집중 된 이온 빔 액체 질소에서 밀링 thinned 있다. tomograms 분자 구조는 화학 고정, 탈수, 또는 포함 하지 않고 기본 상태에 가까운 유지 하는 곳을 알아내는-조건 하에서 수집 됩니다. 규모의 다른 쪽 끝에 해상도, 비용 큰 조직의 볼륨을 분석 하 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사 법은 매력적인 적임 비록 특정 악기4필요 합니다.

전자 현미경 subcellular 어셈블리 및 세포질 과정을 수행 하는 세포의 구조적 맥락을 연구 하는 귀중 한 도구입니다. 방법은 알데하이드와 화학 기정에 의해 조직이 나 세포의 열 대권 외를 보존 하기 위해 개발 되었습니다 또는 높은 압력에 의해 대체 (FS)1,2동결 동결 (HPF) 다음. 포함 된 견본 블록 있습니다 수 sectioned, 스테인드, 그리고 전송 전자 현미경 (TEM)으로 관찰 합니다. HPF 표본 수 또한 처리 cryo-조건 같은 곳을 알아내는 단면 또는 집중 된 이온 빔 (FIB) 밀링, 및 곳을 알아내는-EM3,4에 의해 관찰.
얇은-섹션 안에 유익한 형태학 통찰력 제공, 하지만 결과 2D 이미지만 특정 횡단면의 열 대권 외를 밝힐 수 있다. 3D 볼륨에서 열 대권 외의를 구성 하는 방법을 가려진 남아 있습니다. 세포 열 대권 외의 3 차원에서 시각화를 위해서는 전자 단층 촬영 방법 틸트 이미지의 시리즈 인수 하 고 다시 단층 촬영 개조5 (그림 1)을 생성 하 예상 했다 개발 되었다. 이중 기울기 시리즈 샘플 90 °를 회전 하 고 두 번째 기울기 시리즈를 취득 하 여 수집할 수 있습니다. 이 제한 된 샘플링 각도에서 발생 하는 tomogram의 해상도 개선 누락 쐐기 아티팩트 최소화 됩니다.
여기, 우리는 초파리 간접 비행 근육 (IFM)6,7,,89 의 열 대권 외의 미토 콘 드리 아 연구 직렬 섹션 전자 단층 촬영의 응용 프로그램 설명 . 3D 복원 전체 미토 콘 드리 아 (약 2.5 µ m 두께) 취재를 얻으려면 직렬 섹션 초파리 IFM 조직 블록에서 얻은 했다. 각 섹션의 Tomograms 자동 데이터 수집 소프트웨어를 사용 하 여 개별적으로 수집 했다. 단층 촬영 개조 했다 생성 하 고 직렬 tomograms를 전체 mitochondrion의 재건된 볼륨 아이 모드 패키지와 함께 합류 했다. 결합 된 tomograms는 3D 소프트웨어에 의해 분석 되었다. Cristae 미토 콘 드리 아의 밀도 3 차원에서 조직 공개 세분화 모델을 생성 하 세그먼트 했다.

<table width="852">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:252px;height:40px;">vibrating blade microtome</td>
			<td style="width:123px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:267px;">VT1200S</td>
			<td style="width:212px;">Tissue sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">high-pressure freezer</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>EM HPM100</td>
			<td>Specimen preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">freeze-substitution device</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>EM AFS2</td>
			<td>Specimen preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ultramicrotome</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td>Ultra-thin sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dual-axis tomography holder</td>
			<td>Fischione&#160;</td>
			<td>Model 2040</td>
			<td>tomography collection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">transmission electron microscope</td>
			<td>FEI</td>
			<td>&#160;Tecnai F20</td>
			<td>tomography collection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CCD</td>
			<td>Gatan&#160;</td>
			<td>UltraScan 1000</td>
			<td>tomography collection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Leginon</td>
			<td colspan="2" style="width:388px;">NRAMM/AMI</td>
			<td>tomography collection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">IMOD</td>
			<td colspan="2" style="width:388px;">Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells</td>
			<td>Tomography reconstruction&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Avizo 3D</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>Tomography analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d mitochondrial ultrastructure of drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography

미토 콘 드리 아 ATP, 지질, 및 대사 산물, 뿐만 아니라 칼슘 항상성 및 세포 죽음 통제 세포 강국은. 이 세포 기관이의 독특한 cristae 풍부한 이중 막 열 대권 외 우아하게 생체를 분할 하 여 여러 기능을 수행 하기 위해 배열 된다. 열 대권 외의 미토 콘 드 리아는 연결 되어 속속들이 다양 한 기능; 그러나, 이러한 구조-기능 관계의 좋은 정보는 설명에 시작 됩니다. 여기, 우리가 초파리 간접 비행 근육의 미토 콘 드리 아 구조를 명료 하 게 직렬 섹션 전자 단층 촬영의 응용 프로그램을 보여 줍니다. 직렬 섹션 전자 단층 촬영 3 차원에서 어떤 세포질 구조 연구에 적용할 수 있습니다.

우리는 직렬 섹션 전자 단층 촬영 cristae 미토 콘 드리 아의 구조 기능 분석에 그것의 에너지 상태와 노화 반영 하 적용. 우리 초파리 IFM의 미토 콘 드리 아 통합 형성 했다 cristae 및 매트릭스 3D (그림 4)7네트워크. 또한, 미토 콘 드리 아 DNA 복제 결함 및 가속된 노화 형 돌연변이 파리 양파 모양의 소용돌이 코어 (그림 5)7의 하위 섹션을 포함 하는 미토 콘 드리 아를 축적.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig1.jpg"> 
그림 1: 전자 단층 촬영 개조 기울기 시리즈에서의 일러스트. 실험에서 전자 빔은 개체를 다양 한도로 기울이면 3D 개체를 통해 전달 됩니다. 각 기울기 조건에 대 한 2D 투영은 생성 하 고 카메라와 함께 캡처. 2D 계획은 다시 중앙 조각 정리에 따라 3D 개체를 재구성 하 예상 됩니다. 그림에서 같은 프로세스는 다양 한 기울기 각도에서 단일 차원에 투영 하는 원래 2D 이미지 표시 됩니다. 1 D 계획 다음 2D 이미지를 재구성 하는 데 사용 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig2.jpg"> 
그림 2: 자동 데이터 수집. 직렬 섹션을 포함 하는 슬롯 격자의 아틀라스를 보여주는 소프트웨어의 이미지 뷰어 디스플레이, 미토 콘 드리 아의 대상으로 하 고 취득 다중 스케일 이미지 기울기. 눈금 막대 = 500 µ m (왼쪽된 상단 패널), 100 µ m (왼쪽된 하단 패널), 1 µ m (오른쪽 패널). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig3.jpg"> 
그림 3: 직렬 섹션 전자 초파리 간접 비행 근육에 단일 mitochondrion의 단층 촬영. 2D 현미경 (A) 및 (B) 3D tomograms는 mitochondrion의 전체 볼륨을 덮고 직렬 섹션에서. (C) 조인 된 직렬 섹션 tomograms 섹션을 만드는 한 경도, 수직으로 표시 하는 z 축으로 투영 됩니다. 특히, 조직 단면 소재, 조인된 tomograms 사이의 격차를 떠나의 손실에 지도. 눈금 막대 = 500 nm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig4.jpg"> 
그림 4: 내부-미토 콘 드리 아 cristae 및 매트릭스 네트워크 차원에서 통합. (A) 조각 z 축을 통해 플레이트 막 사이 스위치를 보여주는 미토 콘 드리 아 전자 단층 촬영 개조. (B) 스위칭 오른쪽 손으로 및/또는 왼손잡이 나선 패턴 관찰된 cristae의 삽화. (C) 단층 세분화 보여주는 3 차원 (D) Cristae 스위칭 패턴에에서 왼손잡이 나선 분석 하 고 세분화 모델 (E, F)에 색상 렌더링 했다. Cristae 막 (흰색 밀도)에 걸쳐 측면 매트릭스 confluency (어두운 밀도, 빨간색으로 표시)를 보여주는 단층 쪼 갠 다. (G) 세분화 보여줍니다 측면 매트릭스 confluency (레드) (E)에 tomogram의 모델 및 대표 cristae (회색)에서. 눈금 막대 = 50 nm (A), 200 nm (C), 그리고 300 nm (D, E, F, G). 그림은 장 외 에서 무단 전재 7 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig5.jpg"> 
그림 5: 양파 모양의 소용돌이 코어와 미토 콘 드리 아 노화 중 미토 콘 드리 아 DNA 복제 결함을 가진 파리에 축적. 대표적인 단층 조각 고 보여주는 횡단면 뷰 (위)와 소용돌이 코어의 경도 섹션 보기 (아래) 해당 세분화 (오른쪽 패널). 볼륨 세분화는 소용돌이 코어를 강조 하기 위해 임의의 색상 렌더링으로 표시 됩니다. 눈금 막대: 200 nm. 그림은 장 외 에서 무단 전재 7 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>단계</td>
			<td colspan="2">온도</td>
			<td colspan="2">시간</td>
			<td colspan="2">솔루션</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">--9 0 ° C 140 ° C</td>
			<td colspan="2">30 분</td>
			<td colspan="2">액체 질소</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="2">-90 ° C</td>
			<td colspan="2">96 시간</td>
			<td colspan="2">FS 칵테일</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="2">-90 ° C ~-60 ° C</td>
			<td colspan="2">6 시간 (5 ° C/hr)</td>
			<td colspan="2">FS 칵테일</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">-60 ° C</td>
			<td colspan="2">12 시간</td>
			<td colspan="2">FS 칵테일</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="2">-60 ° C ~-25 ° C</td>
			<td colspan="2">7 시간 (5 ° C/hr)</td>
			<td colspan="2">FS 칵테일</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">-25 ° C</td>
			<td colspan="2">12 시간</td>
			<td colspan="2">FS 칵테일</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td colspan="2">-25 ° C에 0 ° C</td>
			<td colspan="2">5 시간 (5 ° C/hr)</td>
			<td colspan="2">FS 칵테일</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td colspan="2">0 ° C</td>
			<td colspan="2">1 시간 x 3 회</td>
			<td colspan="2">아세톤</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td colspan="2">방 온도</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">수 지 침투</td>
		</tr>
	</tbody>
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3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D 미토 콘 드 리아 열 대권 외의 직렬 섹션 전자 단층 촬영에 의해 밝혀 초파리 간접 비행 근육의

이 프로토콜, 초파리 간접 비행 근육의 미토 콘 드리 아 구조를 명료 하 게 직렬 섹션 전자 단층 촬영의 응용 프로그램 보여 줍니다.

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

3d-mitochondrial-ultrastructure-drosophila-indirect-flight-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

8.4K 조회수.  National Taiwan University. 이 프로토콜, 초파리 간접 비행 근육의 미토 콘 드리 아 구조를 명료 하 게 직렬 섹션 전자 단층 촬영의 응용 프로그램 보여 줍니다.

비디오: 3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

Drosophila의 비행 중 시각 인한 악취 추적

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

연구

생물학

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

골격근에서 Mitochondrial 절연

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

성적인 프로그램을 다시 만들에 의해 인간 배아 줄기 세포에서 Myospheres의 생성

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight muscles (IFMs) of flies, specifically the dorso-longitudinal muscles (DLM), as the experimental subject to measure the atrophic phenotype brought about by different genetic causes. In this protocol, we describe how to embed fly thorax muscles for semi thin sectioning, how to obtain a good contrast between muscle and the surrounding tissue, and how to process optical microscope images for semiautomatic acquisition of quantifiable data and analysis. We describe three specific applications of the methodological pipeline. First, we show how the method can be applied to quantify muscle degeneration in a myotonic dystrophy fly model; second, measurement of muscle cross-sectional area can help to identify genes that either promote or prevent muscle atrophy and/or muscle degeneration; third, this protocol can be applied to determine whether a candidate compound is able to significantly modify a given atrophic phenotype induced by a disease-causing mutation or by an environmental trigger.

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

We report a method to quantify muscle area, which is an indirect method to determine muscle mass in Drosophila adults. We demonstrate the application of our methodology by analyzing the indirect flight muscles in a Drosophila model of Myotonic Dystrophy disease.

초파리 Melanogaster 성인 간접 비행 근육의 광 단면 근육 면적 결정

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

높은 전압 Cryo 전자 단층 촬영으로 박테리아의 DNA 압축의 시각화

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these techniques, cryo soft X-ray tomography (SXT) allows imaging whole cryo-preserved cells in the water window X-ray energy range (284-543 eV), in which carbon structures have intrinsically higher absorption than water, allowing the 3D reconstruction of the linear absorption coefficient of the material contained in each voxel. Quantitative structural information at the level of whole cells up to 10 &#181;m thick is then achievable this way, with high throughput and spatial resolution down to 25-30 nm half-pitch. Cryo-SXT has proven itself relevant to current biomedical research, providing 3D information on cellular infection processes (virus, bacteria, or parasites), morphological changes due to diseases (such as recessive genetic diseases) and helping us understand drug action at the cellular level, or locating specific structures in the 3D cellular environment. In addition, by taking advantage of the tunable wavelength at synchrotron facilities, spectro-microscopy or its 3D counterpart, spectro-tomography, can also be used to image and quantify specific elements in the cell, such as calcium in biomineralization processes. Cryo-SXT provides complementary information to other biological imaging techniques such as electron microscopy, X-ray fluorescence or visible light fluorescence, and is generally used as a partner method for 2D or 3D correlative imaging at cryogenic conditions in order to link function, location, and morphology.

Here, a protocol describing the sample preparation and data collection steps required in cryo soft X-ray tomography (SXT) to image the ultrastructure of whole cryo-preserved cells at a resolution of 25 nm half pitch, is presented.

Cryo Soft X선 단층 촬영에 의한 세포의 3D Cartographic 설명

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.

극저온 전자 단층 촬영 데이터 수집 최적화를 위한 전략

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin by Electron Tomography

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, replication, segregation, etc.) remain poorly understood, partially due to the lack of experimental approaches to high-resolution visualization of specific chromatin loci in structurally preserved nuclei. Here we present a protocol for the visualization of replicative domains in monolayer cell culture in situ,&#160;by combining EdU labeling of newly synthesized DNA with subsequent label detection with Ag-amplification of Nanogold particles and ChromEM staining of chromatin. This protocol allows for the high-contrast, high-efficiency pre-embedding labeling, compatible with traditional glutaraldehyde fixation that provides the best structural preservation of chromatin for room-temperature sample processing. Another advantage of pre-embedding labeling is the possibility to pre-select cells of interest for sectioning. This is especially important for the analysis of heterogeneous cell populations, as well as compatibility with electron tomography approaches to high-resolution 3D analysis of chromatin organization at sites of replication, and the analysis of post-replicative chromatin rearrangement and sister chromatid segregation in the interphase.

This protocol presents a technique for high-resolution mapping of replication sites in structurally preserved chromatin in situ that employs a combination of pre-embedding EdU-streptavidin-Nanogold labeling and ChromEMT.

전자 단층 촬영에 의한 초구조적으로 보존 된 크로마틴의 복제 도메인 이미징

Principles of DNA folding in the cell nucleus and its dynamic transformations that occur during the fulfillment of basic genetic functions (transcription, ...