이 프로토콜은 대량 분광 실험 전에 단백질 생화학 제제를 수행하기 위해 자동화를 사용하여 프로테오믹 연구에 대한 더 높은 처리량과 낮은 가변성을 허용합니다. 이 프로토콜은 더 많은 실험실에 저렴한 저비용 프로그래밍 가능한 액체 처리 시스템을 사용합니다. 우리는 추가 개발을 위해 수정 할 수있는 오픈 소스 Python 스크립트를 제공합니다.
절차를 시연하는 것은 밀턴 아마야, 우리의 실험실에서 석사 학생이 될 것입니다. 시작하려면 noSP3_Digestion 엽니다. 텍스트 편집기의 py 스크립트를 지정하고 사용자 지정 여기만 지정 섹션에서 필요에 따라 실험별 변수를 지정합니다.
그런 다음 Opentrons 앱을 열고 Opentrons 앱의 프로토콜 탭에 스크립트를 업로드합니다. 다음으로 파이썬 스크립트에 지정된 OT2 데크의 해당 위치에 필요한 랩웨어와 파이펫을 배치합니다. 그런 다음, 15밀리리터 플러스 50 밀리리터 튜브 홀더 상단을 가진 4-in-one 튜브 랙의 A1 웰에 암모늄 중탄산염 용액을 배치하고 2밀리리터 튜브 홀더 상단이 있는 4-in-1 튜브 랙의 A1 웰에 단백질 샘플을 배치합니다.
A1에서 시작하여 수직으로 아래로 이동, 온도 모듈의 상단에 배치 알루미늄 블록의 우물에 2 밀리리터 단백질 저결합 튜브를 수동으로 배치합니다. 그런 다음 DTT 용액을 4-in-one 튜브 랙의 A6 웰에 2밀리리터 튜브 홀더 상단을 배치합니다. 로봇이 알루미늄 블록의 샘플 튜브에 중탄산염 버퍼의 적절한 부피를 전송하는 동안 관찰한다.
그런 다음 로봇 프로그램이 일시 중지되고 메시지를 표시하는지 수동으로 확인하여 프로토콜을 다시 시작하기 전에 슬롯 4에 있는 2밀리리터 튜브 랙의 A6에 DTT가 로드되었는지 확인합니다. DTT 튜브의 위치를 확인하고 튜브 캡을 연 후 Opentrons 앱의 이력서 버튼을 클릭하여 계속합니다. 로봇이 DTT 솔루션의 10마이크로리터를 각 샘플에 잘 전송하고 5개의 혼합 라운드를 전달합니다.
그런 다음 로봇 프로그램이 일시 중지되어 메시지를 표시하고 샘플 튜브에서 캡을 닫아야 합니다. 그런 다음 튜브의 캡을 수동으로 닫고 다시 시작하려면 클릭합니다. 로봇의 온도 모듈이 알루미늄 블록을 가열하기 시작하고 온도가 섭씨 55도에 도달하고 5 분 배양하여 샘플이 섭씨 55도까지 얻을 수 있도록 기다립니다.
로봇은 DTT에 의한 단백질 감소를 허용하기 위해 30 분 동안이 온도를 유지합니다. 인큐베이션 중에 요오도아세타미드 용액을 준비하고 알루미늄 호일로 수동으로 감싸빛에 노출되지 않도록 하십시오. 인큐베이션 후 로봇의 프로그램이 일시 중지되고 경고 메시지가 표시되면 샘플 튜브에서 캡을 열고 샘플 튜브를 제한 해제하고 다시 시작하려면 클릭하십시오.
다음으로, 로봇의 프로그램이 경고 메시지와 함께 일시 중지되었는지 수동으로 확인하고, 프로토콜을 재개하기 전에 슬롯 4에 있는 2밀리리터 튜브 랙의 B6에 요오도아세타미드가 로드되었는지 확인합니다. 요오도아세타미드 튜브의 랙 위치를 확인하고 튜브 캡을 연 후, Resume를 클릭하고 로봇이 각 샘플 튜브에 요도아세타미드 용액의 10 마이크로리터를 전송하고 5개의 혼합 라운드를 전송하도록 합니다. 로봇의 프로그램이 일시 중지되고 메시지가 표시되면 샘플 튜브의 캡을 닫고 샘플 튜브를 캡으로 덮은 다음 깨끗한 호일로 알루미늄 블록 전체를 덮고 Resume를 클릭하여 계속합니다.
샘플이 섭씨 22도에서 30분 동안 배양될 때까지 기다린 후, 이오도아세아미드 인큐베이션이 완료되면 로봇의 온도 모듈이 비활성화되도록 하십시오. 로봇의 프로그램이 일시 중지되고 경고 메시지가 표시되면 트립신이 프로토콜을 재개하기 전에 슬롯 4에 있는 2 밀리리터 튜브 랙의 C6에 로드되었는지 확인하고 튜브 캡이 열려있는 2 밀리리터 튜브 랙의 C6 웰에 트립신 솔루션을 배치하고 이력서를 클릭하여 계속하십시오. 그런 다음 로봇의 프로그램이 일시 중지되고 경고 메시지가 표시되면 온도 모듈의 샘플 튜브에 캡을 열고 샘플 튜브를 뚜껑을 열고 다시 시작하려면 다시 시작합니다.
로봇이 트립신 10마이크로리터를 각 샘플 튜브로 옮기고 5개의 혼합 라운드를 전송하는 동안 대기합니다. 하룻밤 동안 트립신 소화 후 벤치탑 미세 원심 분리기를 사용하여 샘플을 잠시 회전시키고 샘플을 자기 튜브 랙에 놓습니다. 2분 후, 피펫으로 상체를 새로운 단백질 저결합 미세원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮기고 샘플을 냉장고에 보관합니다.
다음으로 SP3_peptide_cleanup 엽니다. 텍스트 편집기의 py Python 스크립트를 지정하고 사용자 지정 여기만 하는 섹션에서 필요에 따라 실험 변수를 지정합니다. 그런 다음 Opentrons 앱의 프로토콜 탭에 스크립트를 업로드합니다.
파이썬 스크립트에 지정된 OT2 데크의 해당 위치에 필요한 랩웨어와 파이펫을 배치하고 자기 모듈이 켜져 있고 로봇에 연결되어 있는지 확인합니다. 마그네틱 모듈 상단에 새로운 2밀리리터, 96웰 의 깊은 웰 플레이트를 놓습니다. 다음으로, 소화된 샘플을 A1에서 시작하여 세로로 아래로 이동하는 2밀리리터 튜브 랙에 놓습니다.
그런 다음, 로봇이 소화된 시료의 55마이크로리터를 자기 모듈의 깊은 우물판의 우물로 전송합니다. 로봇 프로토콜이 일시 중지되고 메시지를 표시하는지 확인하고, 준비된 구슬이 프로토콜을 재개하기 전에 슬롯 4에 있는 2밀리리터 튜브 랙의 A6에 로드되었는지 확인합니다. 그런 다음, 소용돌이와 잠시 미니 벤치 탑 원심 분리기에서 SP3 구슬을 회전하고 캡을 열고 2 밀리리터 튜브 랙의 A6 우물에 배치합니다.
로봇 프로그램이 일시 중지되고 메시지를 표시하는지 확인하면 프로토콜을 재개하기 전에 슬롯 5에 위치한 15 밀리리터 의 A4에 80 %의 에탄올이 로드되었는지 확인하십시오. 그런 다음 튜브 랙에 A4에 80% 에탄올 용액을 잘 배치하고 Resume를 클릭하여 계속합니다. 로봇이 파이프팅 속도를 느리게 바꾸고, 각 우물에서 상퍼를 흡인하고, 폐튜브에 분배하는 동안 관찰한다.
로봇이 파이펫팅 속도를 다시 기본값으로 변경하고 자기 모듈을 분리할 때까지 기다립니다. 로봇 프로그램이 일시 중지되고 메시지를 표시하면, 심모늄 중탄산 튜브에 캡을 열고, 암모늄 중탄산염 용액의 캡을 열고, 이력서를 클릭하여 계속합니다. 로봇이 자기 모듈을 분리하는 동안 대기, 각 우물에 암모늄 중탄산염 버퍼의 250 마이크로 리터를 전송하고, 즉시 10 시간 동안 혼합.
그런 다음, 로봇이 파이프팅 속도를 느리게 변경하는 동안 관찰하고, 각 우물에서 폐기물 튜브로 상수체를 전송합니다. 로봇이 각 우물에 암모늄 중탄산염 버퍼의 100 마이크로 리터를 전송하고 즉시 10 번 혼합 될 때까지 기다립니다. 로봇 프로그램이 일시 중지되고 메시지를 표시하는지 확인하고 프로토콜을 다시 시작하기 전에 새로운 수집 튜브가 2밀리리터 알루미늄 블록에 배치되었는지 확인합니다.
그런 다음, 마지막 샘플 튜브 직후 알루미늄 블록에 저단백질 보존 마이크로센심분리기 튜브의 새로운 세트를 배치하고, 계속하려면 Resume를 클릭합니다. 로봇이 심모늄 중탄산염 버퍼의 각 샘플을 새로운 2 밀리리터 튜브로 전송하는 동안 대기합니다. 로봇의 프로그램이 일시 중지되고 메시지를 표시하면 트립신이 프로토콜을 재개하기 전에 슬롯 4에 있는 2 밀리리터 튜브 랙의 C6에 로드되었는지 확인하고 튜브 캡이 열려있는 2 밀리리터 튜브 랙의 C6 웰에 트립신 솔루션을 배치하고 이력서를 클릭하여 계속합니다.
프로그램이 실행완료되면, 파라핀 필름으로 샘플 튜브 캡을 감싸고, 모든 샘플을 온도 제어 믹서로 옮기고, 1, 000 RPM 흔들림으로 16~20시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. BSA 샘플을 사용하면 728펩타이드 스펙트럼 일치 및 65펩타이드의 배지가 각각 5.2%와 3.2%의 변이계로 확인되었다. 복잡한 심장 샘플을 통해 9, 526 펩티드 스펙트럼 일치, 7, 558 펩타이드 및 1, 336 단백질의 배지가 각각 7.6%5.9%와 3.6%의 변이계로 10런에서 확인되었다.
펩티드 정량화의 가변성을 결정하기 위해, 추출된 이온 크로마토그램 강도의 변이계는 독특한 단백질을 매핑하는 10개의 펩타이드에 대해 계산되었다. 인간 대 로봇 실험 결과의 가변이 BCA 분석과 비교했을 때, 로봇 BCA 분석의 평균 계수는 인간 매뉴얼 BCA 분석보다 낮았다. 이 프로토콜은 각 샘플을 처리하는 벤치 시간을 줄입니다.
그것은 우리가 다중 약물 치료 사이 세포주 패널에 있는 proteomics 다름을 탐구하는 쪽을 포장합니다.
