제시된 프로토콜은 동물 조직에서 광범위한 지질을 정량화할 수 있게 한다. 지질 메커니즘을 연구하고 동물 모델에서 초기 독성을 나타내는 바이오마커를 식별하는 쉬운 도구입니다. 이 방법은 샘플당 10분의 추세 시간으로 다양한 샘플 매트릭스에서 14개의 서로 다른 지질 클래스에 있는 400개 이상의 분자 지질에 대한 정량적 프로필을 제공합니다.
시작하려면 원심분리기 분취액 1 상청액을 농도의 2배로 중탄산암모늄 완충액으로 희석합니다. 소혈청알부민 표준곡선을 준비한 후, 표준관을 18, 200 g에서 상온에서 15초 동안 원심분리하여 관을 vortex하였다. 이전에 준비한 표준 튜브에서 블랭크, 표준물질 및 시료 각각 6마이크로리터를 96웰 평평한 바닥 플레이트로 옮깁니다.
다음으로, 250 마이크로리터의 브래드포드 시약을 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰에 첨가하고 혼합한다. 5분 동안 배양한 후 플레이트 리더를 이용하여 595 나노미터 파장에서 흡광도를 측정하였다. 100 마이크로 리터의 중탄산 암모늄 용액이 들어있는 2 밀리리터 튜브를 전체 블랭크 및 내부 표준 블랭크의 각 튜브에 준비하고 모든 샘플을 얼음에 보관하십시오.
10개의 샘플 세트 사이에 하나의 품질 관리 샘플이 배치되는 것을 고려하여 품질 관리 샘플을 준비합니다. 10 마이크로 리터의 풀링 된 인간 혈장을 2 밀리리터 튜브에 추가 한 다음 10 마이크로 리터의 내부 표준 용액을 모든 내부 표준 블랭크, 품질 관리 및 연구 샘플에 스파이크합니다. 섭씨 영하 20도 부탄올 메탄올 혼합물 300 마이크로 리터를 각 시료에 넣고 써모 믹서에서 실온에서 10 분 동안 450g에서 흔들어줍니다.
다음으로, 헵탄 에틸 아세테이트 혼합물 300 마이크로 리터를 첨가하고, 써모 믹서 상에서 실온에서 10 분 동안 450 g에서 흔들어 준 다음, 1 % 고행산 혼합물 300 마이크로 리터를 첨가하고, 써모 믹서 상에서 실온에서 450 g에서 5 분 동안 흔들어. 실온에서 5 분 동안 2, 800 g에서 원심 분리하고 상부 상 360 마이크로 리터를 2로 표시된 새로운 2 밀리리터 자동 잠금 튜브로 옮깁니다. 320 μL의 헵탄 에틸 아세테이트를 1로 표시된 수상 튜브에 첨가 한 후, 열 혼합기에서 실온에서 5 분 동안 450 g에서 흔들어 준 다음, 이전에 입증 된대로 실온에서 5 분 동안 2, 800 g에서 원심 분리한다.
상부 상 320 마이크로리터를 옮기고 튜브 2에서 이전 단계의 분획과 결합합니다. 유사하게, 250 마이크로 리터의 헵탄 에틸 아세테이트를 튜브 1의 수상에 첨가하고 열 혼합기에서 실온에서 5 분 동안 450g에서 흔들어줍니다. 다시, 실온에서 5 분 동안 2, 800 g에서 원심 분리 한 다음, 상부 상 200 마이크로 리터를 옮기고 튜브 2의 이전 단계의 분획과 결합시킨다.
진공 농축기에서 섭씨 35도에서 증발시켜 건조시키고 300마이크로리터의 MS 혼합 용액에 다시 용해합니다. 모든 것이 용해되도록 각 튜브를 5 초 동안 소용돌이 치고 섭씨 4도에서 5 분 동안 18, 200g에서 원심 분리합니다. 양성 이온화 모드 분석을 위해 50마이크로리터의 분취량을 마이크로리터 플레이트에 옮기고 50마이크로리터의 MS 혼합 용액으로 희석합니다.
다시, 80 마이크로리터의 MS 믹스로 희석하고 음이온화 모드 분석을 위해 20 마이크로리터의 분취량을 MTP 플레이트에 옮긴다. 플레이트를 호일로 감싸고 분석 전에 섭씨 4도를 유지하십시오. 분석 전 5일 이내에 제조업체의 지침에 따라 양성 및 음성 모드 모두에서 MS를 보정합니다.
직접 주입 나노 소스를 미리 설치하여 MS의 이송 모세관과 칩 홀더에 4.1마이크로미터 노즐 칩이 제대로 정렬되었는지 확인한 다음 1.25psi의 가스 압력, 1.1킬로볼트의 소스 전압, 5마이크로리터의 샘플 주입 부피에 해당하는 양극 및 음극 주입 매개변수를 확인합니다. 출력 접점 폐쇄 Rel1 2.5초, 배달 시간 5분, 플레이트 냉각 섭씨 4도, 온도 컨트롤러를 설정하고 새 플레이트를 만듭니다. 포지티브 모드의 경우 MS 분석법이 모세관 온도가 섭씨 250도이고 S 렌즈 RF 레벨이 65.0으로 설정되어 있는지 소프트웨어를 확인하고 조정합니다. Xcalibur 소프트웨어에서 포지티브 방법을 열고 140, 000 해상도에서 550에서 1, 000 m/z 범위에서 0분에서 1분까지 0분에서 1분까지 전체 스캔 MS 획득이 설정되어 있는지 확인하고 100만 개의 자동 게인 제어 및 50밀리초의 최대 주입 시간을 제공합니다.
680.48022의 잠금 질량을 적용합니다. 데이터 독립적인 MS/MS 수집 분석법이 250 m/z의 고정된 첫 번째 질량으로 17, 500 분해능에서 1분과 5분 시간 범위 사이에 설정되어 있는지 확인하십시오. MS2에 대한 자동 이득 제어가 100, 000, 최대 주입 시간 64 밀리 초, 충돌 에너지 20 NCE, 절연 창 1 m / z, 포함 질량 목록 398에서 1, 100 m / z가 1 Dalton의 질량 단계로 사용되는지 확인하십시오.
네거티브 모드에서 획득하는 경우, MS 분석법이 MS tune 파일에서 65.0의 S-렌즈 RF 레벨에서 섭씨 250도의 모세관 온도로 설정되어 있는지 튜닝 소프트웨어를 체크인합니다. 다음으로, Xcalibur 소프트웨어에서 전체 스캔 획득 모드가 400 - 940 m/z 범위를 포괄하는 140, 000 해상도에서 0분에서 1분까지, 100만 개의 자동 게인 제어, 200밀리초의 최대 주입 시간 및 526.46262의 잠금 질량으로 설정되어 있는지 확인합니다. DIA 모드에서의 MS2 획득이 150 m/z의 고정된 첫 번째 질량, 100, 000, 64 밀리초의 최대 주입 시간 및 35 NCE의 최대 주입 시간의 자동 이득 제어, 1 Dalton의 질량 스텝으로 400에서 940까지의 포함 질량 목록을 사용하여 17, 500의 분해능에서 실행 1분에서 5분 사이에 설정되었는지 확인합니다.
포지티브 모드에서 Xcalibur 소프트웨어에서 분석 시퀀스 대기열을 생성하고 트리거한 다음 ChipSoft 소프트웨어에서 시퀀스를 생성하고 각 샘플에 대해 직접 주입 로봇에서 오는 접촉 폐쇄 신호에 의해 샘플 수집이 트리거될 때까지 기다리는 동안 분석을 시작합니다. 포지티브 모드 분석이 완료되면 네거티브 모드에서 Xcalibur 소프트웨어에서 분석 시퀀스 대기열을 생성하고 트리거한 다음 ChipSoft 소프트웨어에서 시퀀스를 생성하고 각 샘플에 대해 직접 주입 로봇에서 오는 접촉 폐쇄 신호에 의해 샘플 수집이 트리거될 때까지 기다리는 동안 분석을 시작합니다. 총 정규화된 지질 농도는 PE, PEO, PC, PCO, PI 및 PG 지질 클래스에 대해 약간 상승된 14개의 가장 풍부한 지질 클래스로부터 확인 및 정량화되었으며 SM, LPE 및 PA 지질에 대해 일부 하향 조절이 관찰되었습니다.
TAG와 PS에서는 차이가 없습니다. 이러한 결과는 또한 전체 분자식에 기초한 분자 특징 중 100 내지 120 화합물이 담배 연기 노출에 의해 유의하게 영향을 받았다는 것을 보여준다. MS2 단편화의 디콘볼루션과 단편 신호 강도의 정규화를 통해 각 지질 유리에 표시된 각 공액 지방산의 총량을 대략적으로 정의하고 노출군과 대조군 간의 이러한 데이터를 비교할 수 있었습니다. 완전 포화 및 소수의 불포화 지방산의 감소가 관찰된 반면, PC, PE 및 PG 인지질 부류의 조성에서 고도불포화 지방산은 모든 시점에서 담배 연기 그룹에서 상승했습니다.
에이코사펜타엔산 및 도코사헥사엔산과 결합된 PC 및 PG의 극단적인 경우는 3R4F CS 노출군에서만 검출되었습니다. 시료 및 QC 시료의 피펫팅은 저대역 팁으로 수행되어야 하며 정확해야 하며, 이는 각 시료 사이에서 팁을 확인해야 함을 의미합니다. 내부 표준물질 용액의 피펫팅은 매우 중요하며 정확해야 합니다.
1 내지 1 디클로로메탄 메탄올의 용액은 주의해서 다루어야 하며, 샘플에 플라스틱 폴리머가 포함되지 않도록 팁을 함유한 비가소제를 사용해야 합니다. 팁은 각 샘플 간에 변경되어야 합니다.
