이 프로토콜은 일반적으로 아무도 없는 Drosophila에 있는 성인 신경 발생을 유발하는 중앙 두뇌 상해 방법을 보여주기 때문에 중요합니다. 우리는 성인 신경 발생의 근본적인 분자 기계장치를 이해하기 위하여 이 기술을 사용하는 것은 인간 적인 신경 재생과 관련될 것이라는 점을 예상합니다. 이 기술을 배우려면 인내와 인내가 필요합니다.
분석을 위해 뇌를 수집하기 전에 몇 주 동안 매일 5~10개의 뇌를 연습하는 것이 좋습니다. 이산화탄소 패드에 파리를 마취 한 후. 새로 폐쇄 된 F1 젊은 남성은 백과 의 6 시간 이내에 파리를 정렬하고 유리병 당 40 개 이하의 파리가있는 음식이 들어있는 깨끗한 유리병에 넣습니다.
EdU와 분할 세포를 라벨링할 계획이라면 10% 자당에 50mill 이상의 EdU20 마이크로리터를 준비하고 23mm 원형 3필터 용지에 준비된 용액을 빈 유리병에 놓으면, 부상 6시간 전에 수컷 파리를 바이알에 놓습니다. 다음으로, 미누티엔 핀을 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 5분 동안 70%에탄올로 채워진 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 배치하여 소독합니다. 그런 다음 70%에탄올을 분사하고 깨끗한 보풀이 없는 조직으로 건조를 닦아 이산화탄소 패드와 페인트 브러시를 살균합니다.
공구가 깨끗하고 건조하면 40개 이하의 정렬된 F1 수컷을 깨끗한 패드에 옮기고 두 그룹으로 분리합니다. 한 그룹은 부상없는 파리를 제어하는 역할을합니다. 그리고 두 번째 실험 그룹은 외상성 뇌 손상을 관통하게 될 것입니다.
다음으로, 포셉을 사용하여 마이크로 원심분리기 튜브에서 4~5개의 새로운 Minutien 핀을 꺼내 이산화탄소 패드의 가장자리 근처에 놓습니다. 그런 다음 해부 범위에서 날카로운 점을 가진 직선 Minutien 핀을 선택합니다. 날카로운 핀을 재사용하고 손상되거나 무딘 핀을 70%에탄올이 들어 있는 별도의 튜브에 배치하여 안전한 폐기를 합니다.
다음으로, 440 내지 460 나노미터에서 흥분을 허용하고 500 ~ 560 나노미터에서 시각화를 허용하는 녹색 형광 단백질에 대한 적절한 흥분 및 방출 필터가 장착 된 스테레오 현미경 LED 램프에 표준 교차 유전자형 스위치가있는 파리의 경우. 그런 다음 실험군을 플라이로 선택하고, 실험자가 머리 캡슐의 등갈뷰를 가지도록 하여 파리를 오른쪽으로 향하게 한다. 집게를 사용하여 선택한 Minutien 핀을 한 손에 들고 다른 한편으로는 페인트 브러시를 잡습니다.
그런 다음 등두부 의 앞쪽에 브러시를 놓고 부드럽게 아래로 밀어 서 비행을 안정화시하십시오. 머리 오른쪽에 있는 버섯 몸체에서 미누티엔 핀의 끝을 조준하고 머리 캡슐을 관통합니다. 랜드마크를 사용하는 경우 오셀리와 눈의 등갈림 사이의 등두부 큐티클을 대상으로 합니다.
부상을 완료 한 후, 페인트 브러시를 사용하여 미누티엔 핀에서 머리를 부드럽게 밀어 넣습니다. RNA 염기서열 분석 또는 QRT PCR에 대 한 뇌를 사용 하는 경우 우리 머리의 왼쪽에 두 번째 부상을 확인. 모든 실험용 파리가 다친 후 통제하고 부상당한 파리는 음식이 들어있는 별도의 라벨이 부착된 바이알로 날아갑니다.
유리병이 음식에 잡히는 것을 막기 위해 유리병을 수평으로 놓습니다. 표준 크로스 파리를 섭씨 25도에 놓고 퍼마트윈은 섭씨 30도에서 1세까지 날아갑니다. 24시간 이상 노화하면 1~2일마다 깨끗한 음식으로 파리를 옮깁니다.
증식의 현저한 증가는 항 pH3를 사용하여 부상 후 24시간 동안 적극적으로 미토시스를 앓고 있는 세포에 대한 마커를 관찰하였다. 대략 3개의 pH3 양성 세포는 제어 중앙 두뇌의 각에서 관찰됩니다. 그리고 부상당한 중앙 뇌의 각각에 11 pH3 양성 세포.
7일까지, 2개의 EdU 양성 세포의 평균은 각 대조군 세포 두뇌에 존재합니다. 그리고 11 EdU 양성 세포는 각각의 부상당한 중앙 뇌에서, 이는 pH3 항체를 가진 24 시간 후 상해를 얻은 결과와 유사하다. 에서 14 일 제어 중앙 두뇌 당 하나의 EdU 양성 세포를 평균, 부상 뇌 평균 29 중앙 뇌 당 EdU 양성 세포.
세포 증식은 관통 외상성 뇌 손상 다음 두 번째 주에 적어도 계속 한다는 것을 보여주는. 뇌가 백과상 후 처음 24시간 이내에 부상을 입을 때 중앙 뇌에서 가장 강력한 증식 반응이 관찰됩니다. 7일까지 관통 후 관통하는 부상은 여전히 증식의 상당한 증가를 야기한다.
그러나, 14 일까지, 세포의 분할 능력은 두뇌 당 1개의 분할 세포로 현저하게 감소합니다. 이는 제어 두뇌의 것과 유사합니다. 퍼마트윈 라벨링 시스템을 사용하여 더 많은 퍼마윈 클론은 대조군과 비교하여 2주 만에 2일 만에 부상당한 샘플에서 검출되었다.
부상 후 시간이 지남에 따라 클론의 수가 증가함에 따라. 부상 후 2 주 동안 새로운 버섯 몸 뉴런이 있었다 50% 부상 뇌의. 이 새로운 뉴런은 버섯 몸 칼립스에 대략 그들의 원원기를 투영하고, 버섯 바디 엽에 축축을 투영했습니다.
재생되는 것으로 나타난 뇌의 다른 영역은 타원성 몸 안테나 로브와 측면 경적을 포함한다. 무딘 또는 구부러진 핀의 사용으로 뇌 손상을 할 때 날카로운 Minutien 핀을 사용 하 여 사망률을 증가 시킬 것 이다. 또한 페인트 브러시로 파리를 너무 세게 밀어 붙이지 않도록하십시오.
이 절차에 따라 면역 히스토케는 자기 증식을 정량화하고 새로운 뉴런과 신경을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.
