이 프로토콜은 Chagas 질병에 대한 신약 후보를 확인하기 위해 Trypanosoma cruzi의 세 가지 수명주기 단계에서 높은 처리량 비색 분석을 설명합니다. 이것은 쉽고 빠르며 재현 가능한 방식으로 트립파노시달 화합물을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 Pamela crib의 실험실에서 실험실 세포 배양 기술자 인 Romina Manarin이 될 것입니다.
T-25 조직 배양 플라스크에서 트립파노소마 크루지 에피마스티고테스를 발현하는 베타 갈락토시다제를 배양함으로써 시작하고, 이들을 축삭 방향으로 성장시키기 위해 섭씨 28도에서 배양한다. Neubauer 챔버를 사용하여 계대 배양하기 전에 기생충 성장을 정량화하십시오. 배양물을 로그 페이즈로 유지하기 위해, 10%FCS 및 설페이트 중의 제네티신이 보충된 5밀리리터의 LIT 배지에서 밀리리터당 200마이크로그램의 최종 농도로 48 내지 72시간마다 계대배양한다.
그런 다음 수직 위치에서 섭씨 28도에서 배양하기 전에 뚜껑을 단단히 닫으십시오. 로그상 배양으로부터, 밀리리터 당 에피마스티고테 당 200, 000 세포의 최종 농도에서 제네티신 및 설페이트로 보충된 LIT 배지에서 에피마스티고테의 현탁액을 만든다. 96 웰 플레이트의 웰 당 100 마이크로리터의 현탁액을 분배한 후, 웰 200 마이크로리터의 최종 부피를 배지로 메이크업한다.
2%FCS가 보충된 DMEM의 베로 세포 현탁액을 밀리리터 당 100, 000 세포의 최종 농도로 만드십시오. 현탁액을 웰당 100 마이크로리터의 시드를 96 웰 조직 배양 플레이트에 넣는다. 부착을 위해 하룻밤 동안 세포를 인큐베이션하고 다음날 현미경으로 세포를 관찰한다.
다음날, 베로 세포 단일층을 100 마이크로리터의 멸균 PBS로 세 번 헹구었다. 이전에 얻은 메타시클릭 트리포마스티고트를 첨가한다. 웰 당 2 % FCS로 보충 된 DMEM 100 마이크로 리터에 10-1의 감염 또는 MOI의 다중성을 추가하고 이전에 입증 된 바와 같이 6 시간 동안 배양하십시오.
인큐베이션이 끝나면 플레이트를 PBS로 두 번 세척하고 2 %FCS로 보충 된 페놀 레드없이 100 마이크로 리터의 DMEM을 첨가하십시오. DMEM에서 베로 세포 현탁액을 만든 후 밀리리터 당 1 백만 세포의 최종 농도를 추가한다. 시드 800, 000 세포를 T-25 플라스크에서 배지의 5밀리리터에 넣고 세포 부착을 위해 밤새 인큐베이션한다.
플라스크를 PBS로 헹구고 나면, 트립포마스티고트를 첨가하고, 2%FCS로 보충된 DMEM 5밀리리터에 10-1의 MOI를 첨가하고, 이전에 입증된 바와 같이 밤새 인큐베이션한다. 인큐베이션이 끝나면 플라스크를 PBS로 두 번 세척하십시오. 2 % FCS로 보충 된 신선한 DMEM 다섯 밀리리터를 넣고 나흘 동안 배양하십시오.
인큐베이션의 끝에서, 트립포마스티고트의 존재에 대한 상청액을 광학 현미경으로 관찰한 후. Neubauer 챔버를 사용하여 트립포마스티고트를 정량화합니다. 상층액을 15 밀리리터 튜브에 수집하고, 실온에서 10분 동안 7, 000배 G에서 원심분리한다.
그 후 상층액을 버리고 2%FCS로 보충된 페놀 레드 없이 DMEM에 펠렛을 재현탁시켜 밀리리터당 1백만 트리포마스티고트의 농도를 얻었다. 웰당 100 마이크로리터의 트립포마스티고트 현탁액을 96 웰 플레이트에 시드한다. 텍스트 원고에 설명 된대로 epimastigotes, amastigotes가있는 Vero 세포 또는 trypomastigotes에 benznidazole 용액을 추가하십시오.
그런 다음 epimastigotes를 배양하고, 섭씨 28도를 72 시간 동안 설정하고, 트리포 마스티고트 또는 감염된 베로 세포를 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 24 시간 동안 아마스티고테스로 감염시켰다. 비색 검정을 위해, PBS 또는 상응하는 배지 100 마이크로리터를 첨가하여 블랭크 웰을 설정한다. 다음으로, 40 마이크로리터의 CPRG 기질 용액과 10 마이크로리터의 세제 용액을 각 웰에 첨가하여 각 웰에 250 마이크로리터의 최종 부피의 200 마이크로몰 CPRG 및 0.1% 세제의 최종 농도를 얻는다.
배양 후, 섭씨 37도에서 두 시간 동안, 마이크로플레이트 분광광도계를 이용하여 595 나노미터에서 흡광도를 측정하였다. 소프트웨어에서 흡광도를 감지 방법으로 선택하고 끝점을 읽기 유형으로 선택하여 새 프로토콜을 만든 다음 확인을 클릭하십시오. 그런 다음 읽기 단계를 추가합니다.
선택한 파장을 입력하고 확인을 클릭합니다. 플레이트 레이아웃 섹션에서 읽을 웰을 표시하고 확인을 클릭 한 다음 읽기 플레이트를 클릭하고 값이 화면에 나타날 때까지 기다렸다가 스프레드 시트로 내보내 결과를 분석하고 원고에 설명 된대로 빼기를 사용하여 흡광도 값을 계산합니다. 통계 분석 소프트웨어에서 BZN의 농도 대 595 나노미터에서의 흡광도를 XY 표에 플로팅합니다.
분석을 클릭하고 변환 옵션을 선택한 다음 확인을 클릭하여 BZN 농도를 로그 값으로 변환합니다. IC50 값을 얻으려면 분석을 클릭하고 XY 분석 목록에서 비선형 회귀 곡선 맞춤을 선택한 다음 확인을 클릭합니다. 다음으로, 매개 변수 창으로 이동하여 모델 탭에서 내장 방정식의 용량 반응 억제 그룹으로 이동하여 용량 반응 방법이 다른 모든 탭을 기본값으로 남겨 두면 로그 억제제 대 반응 변수 기울기를 매개 변수에 대해 선택한 다음 확인을 클릭하십시오.
결과 섹션을 클릭하여 IC50 값, SD 및 적합도의 우수성을 찾습니다. 그래프 섹션을 클릭하여 약물의 로그 농도 대 흡광도 값의 XY 그래프를 찾고 곡선 맞춤도 다른 색상으로 그래프로 표시되는지 확인하십시오. 본 연구에서, epimastigottes에 대해 수득된 IC50 값은 이전 연구와 유사하게 대략 20 마이크로몰이었다.
또한, 상기 결과는 시간에 따른 에피마스티고테스의 라이너 베타갈락토시다제 활성을 나타내었다. 최소한 테스트된 각 조건의 반복실험을 수행하고 볼륨 관리에서 오류를 최소화하는 것이 매우 중요합니다.
