이 방법은 항 멜라노겐성 활동을 가진 기능성 화장품 및 피부제의 개발에 도움이 될 수 있다. 그것은 수행해야하고 결과를 신속하게 얻을 수있다. 또한, 이 방법은 연구자에게 유용할 수 있으며, 이들은 효과 나 화합물을 식별하거나 조사하거나 antimelanogenic 또는 프로멜라노겐성 활동을 조사하려는 사람들에게 유용할 수 있다.
티로시나아제 활성을 측정하기 위해 B16-F10 멜라니시드제를 세포 배양 인큐베이터에서 24시간 동안 완전한 배지에서 24웰 플레이트 농도의 웰당 5배 10~4번째 세포로 시드하는 것으로 시작한다. 다음 날, 갓 준비된 테스트 화합물 및 억제제 또는 음의 제어로 보충된 DMEM으로 각 우물의 상체를 교체하고 플레이트를 인큐베이터로 72시간 동안 반납한다. 치료가 끝나면 우물을 두 번 헹구고 300 마이크로리터의 차가운 PBs를 잘 헹구고 접시를 얼음 위에 놓습니다.
다음으로 셀 스크레이퍼를 사용하여 각 웰에 300 마이크로리터의 용해 버퍼를 추가하여 5분 후에 셀 용액을 수집합니다. 결과 세포 입자 현탁액을 개별 1.5 밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 전달합니다. 그리고 세포 간 티로시나아제를 방출하기 위해 얼음에 14, 500 rpm에서 2 초 동안 3 번 용해.
원심분리에 의해 세포 파편을 펠렛하고 얼음에 개별 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에 슈퍼 네이션을 전송합니다. 명확한 96 개의 잘 폴리스티렌 마이크로 플레이트의 개별 우물에 각 수퍼티의 70 마이크로 리터를 할당하고 140 개의 미세 리터의 티로시나제 기판 용액을 각 수퍼 나탄에 추가합니다. 접시를 부드럽게 흔들어 잘 내용을 혼합합니다.
그런 다음 접시를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 그리고 마이크로 플레이트 판독기에서 475 나노미터에서 티로시나제 활성을 측정합니다. 치료된 세포의 리세이트를 수집한 후 세포의 멜라닌 함량을 측정하기 위해 입증하였다.
원심분리로 용액을 수집하고 수퍼네이션을 새로운 튜브로 옮긴다. 각 펠릿에 일반 수산화 나트륨 300마이크로리터를 섭씨 60도에서 1시간 배양합니다. 이어서 용존 셀 현탁액의 원심분리.
그런 다음 슈퍼나티의 200 마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰에 옮기합니다. 그리고 400 나노미터 파장에서 마이크로 플레이트 판독기의 멜라닌 함량을 측정합니다. 폰타나-마슨 스테닝의 경우, 300 마이크로리터의 콜드 PBs로 처리된 세포를 두 번 세척하고 섭씨 4도에서 1시간 동안 10%의 미공식적으로 200마이크로리터로 세포를 고정합니다.
증류수로 두꺼운 세포를 헹구고 58~68도의 마이크로리터 200개를 각 우물에 암모니아칼 실버 작업 용액을 추가합니다. 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하거나 세포가 황갈색이 될 때까지. 증류수로 얼룩진 세포를 헹구고 실온에서 0.1%의 금염화물로 2분 배양합니다.
금 염화물 처리 된 세포를 증류수로 헹구고 세포에 200 마이크로 리터의 나트륨 티오툴페이트 용액을 추가하십시오. 2 분 후에 세포를 다시 헹구십시오. 그리고 5 분 동안 잘 당 핵 고속 적색의 200 마이크로 리터로 세포를 레이블.
그런 다음 빛 현미경으로 이미징하기 전에 수돗물로 얼룩진 세포를 씻으릅니다. 임계값 분석의 경우 이미지 J에서 이미지를 열고 이미지를 선택하고 이미지, 조정 및 색상 임계값을 선택합니다. 폰타나 매슨으로 염색된 영역을 측정하기 위해 밝기 매개변수 막대를 0으로 설정하고 모든 검은색 또는 갈색 스테인드 셀이 포함된 지점으로 밝기를 조정합니다.
파티클 분석 및 분석을 선택하고 파티클 분석 창에서 요약 상자를 확인한 다음 확인을 클릭하여 결과의 요약을 얻고 데이터를 스프레드시트에 복사하고 붙여넣습니다. Arbutin 처리는 대조군 차량 처리 세포에 비해 세포 티로시나제 활성을 현저하게 억제합니다. 마찬가지로 Arbutin으로 자극된 세포의 멜라닌 함량은 대조군에 비해 현저히 감소된다.
세포는 치료 단 사이에서 형태학적으로 유사하더라도, Arbutin는 대조군 처리된 세포에 비해 검은 색소의 면적을 감소시다. 이 방법은 복합 라이브러리를 사용하여 스크리닝하는 데 유용합니다. 신속하게 테스트할 샘플의 수백 이상이 있습니다.
또한이 방법은 멜라노발생과 관련된 메커니즘을 조사하는 데사용할 수 있습니다. 생리 활성 후보 화합물이 확인 된 후, 생물학적 메커니즘 또는 상업적 응용 프로그램의 연구에 대한 자신의 증언.
