이러한 접근법은 신생아 생체외 마우스 심장의 역행 관류를 삼분 이내에 확실하게 확립한다. 따라서 연구의 가능한 가장 어린 나이를 몇 주에서 출생 후 10 일로 줄입니다. 이 고립 된 역행 관류 모델은 유 전적으로 수정 가능하고 저렴한 종에서 심장 발달의 중요한시기에 신생아 심장을 연구 할 수있게합니다.
이 모델은 신생아 심장에서 허혈 - 재관류에 대한 생리 학적 및 약리학 적 반응의 연구에 도움이되지만. 또한 심근세포 분리에도 활용될 수 있다. 신생아 마우스 대동맥 캐뉼라를 제작하려면 날카로운 가위를 사용하여 팁을 자르고 26 게이지 스테인레스 스틸 바늘의 끝을 무릎 꿇고 바늘 루멘의 직경을 크림프하거나 제한하지 않도록주의하십시오.
그런 다음 절단면을 부드럽게하여 실험실 벤치 상단의 무딘 끝을 부드럽게 긁어 내고 이리저리 움직여 버를 제거하십시오. 다음으로, 제작된 캐뉼러를 Langendorff 장치에 부착하고 유동 및 저항을 평가합니다. 캐뉼러를 통한 유속을 측정하여 일분 간격으로 버퍼 양을 수집하고 측정합니다.
Krebs-Heneseleit 버퍼가 흐르는 동안 캐뉼라를 가로지르는 압력 차이를 정량화하려면 캐뉼라가 부착되거나 부착되지 않은 시스템의 압력을 측정하십시오. 그런 다음 다음 공식을 사용하여 캐뉼라 저항을 계산하십시오. 다음으로, Langendorff 장치로부터 26 게이지 캐뉼러를 제거하고 장치의 캐뉼레이션 부위에 고압 튜브를 부착하십시오.
그런 다음 대동맥 캐뉼라를 튜브의 원위 단부에 부착하고 튜브와 캐뉼라를 산소화 버퍼로 공기내어 모든 기포가 제거되도록합니다. 관상 동맥 미세 혈전의 형성을 방지하려면 1 밀리리터 주사기에 26 게이지 바늘을 사용하여 10 일 된 마우스 강아지에게 헤파린을 복강 내 주사하십시오. 마취제 주사를 진행하기 전에 헤파린이 순환 할 때까지 몇 분 정도 기다리십시오.
다음으로, 마취 된 마우스를 수핀 위치에 놓고 의식 상실시 즉시 팔다리를 고정하십시오. 동물이 발가락 꼬집음에 반응하지 않는 즉시 수확을 시작하십시오.동물은 초기 해부 중에 자발적으로 호흡합니다. 직선 해부 가위를 사용하여 복강을 노출시키는 동물 너비를 가로 질러 횡방향 아시 포이드 절개를 만듭니다.
조수에게 포셉으로 xiphoid 과정을 파악하도록 요청한 다음 흉곽을 두개 방향으로 중간 겨드랑이 선을 따라 양측으로 자르고 흉골과 갈비뼈를 두개골로 반사하여 흉부 장기를 노출시킵니다. 횡격막을 우월하게 확인한 후 앞부분을 완전히 절개하십시오. 간 위의 방사선 실용성 열등한 정맥 카바를 확인하고 곡선 아이리스 가위로 횡단하면서 아이리스 포셉으로 근위 세그먼트의 두개 긴장으로 약간의 내부를 유지하십시오.
그런 다음 구부러진 아이리스 가위를 사용하여 척추의 내부 표면을 따라 후방으로 자르고 열등한 정맥 카바를 흉강 밖으로 당깁니다. 심장이 동원되면 가위를 앞쪽으로 각도를 맞추고 큰 혈관을 우월하게 절단하여 심장과 폐를 완전히 제거하십시오. 즉시 얼음처럼 차가운 Krebs-Henseleit 완충액 또는 식염수에 시편을 잠급니다.
심장은 몇 초 안에 박동을 멈춰야합니다. 얕은 페트리 접시의 바닥에 종이 타월 한 장을 놓아 마찰을 일으켜 통조림 중에 심장을 안정시킵니다. 종이 타월에 얼음처럼 차가운 크렙스-헨셀릿 버퍼를 적셔 심장이 그것에 달라붙지 않도록 하십시오.
준비된 페트리 접시를 해부 현미경 아래에 놓고 초점을 조정하십시오. 이제 해부 현미경 아래에 고압 연장 튜브에 부착 된 대동맥 캐뉼라를 허브 주위에 느슨하게 묶은 5-0 실크 봉합사와 함께 놓습니다. 적출 된 흉부 장기를 페트리 접시에 넣은 후 흰 광택과 두 개의 엽으로 흉선을 확인하고 흉선이 앞쪽에 있고 우월하도록 표본의 방향을 정하십시오.
다음으로, 포셉을 사용하여 큰 혈관을 노출시키는 흉선의 엽을 무뚝뚝하게 분리합니다. 그런 다음 대동맥 아치의 구별되는 분기 특징을 찾아 대동맥을 확인하고 미세한 날카로운 가위를 사용하여 쇄골 하부 동맥 이륙에 근접하여 대동맥을 횡단합니다. 이제 보석상 스타일의 미세한 곡선 포셉을 사용하여 횡단 된 대동맥을 부드럽게 잡고 26 게이지 무딘 바늘로 대동맥을 조심스럽게 캐뉼레이트하여 대동맥 밸브가 손상되지 않도록주의하십시오.
미세한 곡선 포셉을 사용하여 캐뉼라 주변의 대동맥을 잡고 허혈성 시간을 제한하기 위해 역행 관류를 시작하십시오. 조수에게 느슨하게 묶인 봉합사의 끝을 잡고 캐뉼라 주위의 대동맥을 조심스럽게 감싸도록 요청하십시오. 미세한 곡선 포셉 위 또는 아래에 봉합사를 조인 다음 봉합사를 조이고 관상 동맥 흐름의 적절성을 확인하십시오.
Langendorff 장치에서 고압 튜브를 분리하고 캐뉼라의 허브를 잡고 고압 연장 튜브에서 무딘 바늘을 분리하십시오. 그런 다음 캐뉼라의 허브를 장치에 빠르게 부착하십시오. 심장이 일반적인 위치에서 Langendorff 장치에 매달려 있으면 적절한 관류가 확인됩니다.
폐, 흉선 및 과도한 조직을 조심스럽게 다듬으십시오. 그런 다음 관상 동맥 부비동 유출물이 자유롭게 물방울을 떨어 뜨릴 수 있도록 오른쪽 아트리움을 절개하십시오. 5-0 실크 봉합사 끝에 작은 매듭을 만든 다음 바늘로 파라핀 필름의 작은 조각을 관통하고 파라핀을 매듭 된 끝으로 밀어 넣습니다.
조심스럽게 바늘을 심실의 정점을 통과시키고 파라핀 필름이 심실의 측벽에 맞을 때까지 심장을 통해 봉합사를 당깁니다. Langendorff 장치의 물이 채워진 온난 한 재킷의 개구부를 통해 바늘을 통과시켜 심장을 감싸고 따뜻하게 할 수 있도록하십시오. 그런 다음 관상 동맥 부비동 물방울을 피하면서 힘 변환기에 바늘을 부착하십시오.
봉합사를 조정하여 이완기 긴장 또는 나디르 의도 추적에 의해 지시 된대로 하나 내지 두 그램의 기저 장력을 적용하십시오. 그런 다음 심전도를 기록하기 위해 심장의 우수하고 열등한 극에 표면 전극을 놓습니다. 마지막으로, 분석을 위해 관상동맥 부비동 유출물을 24 게이지 정맥내 카테터를 사용하여 샘플링한다.
표면 전극은 연속 심전도를 기록하는 데 사용되었으며, 이는 고유 속도와 리듬을 결정할 수있었습니다. 적절하게 관류 된 모든 심장은 부비동 리듬으로 자발적으로 뛰고 있습니다. 이 관류 전략은 무시할 수있는 젖산 생산과 낮은 비율의 산소 추출 및 포도당 소비를 감안할 때 신생아 마우스 심장의 신진 대사 요구를 충족 시켰습니다.
평균 탈핵된 고유 심박수 및 평균 관찰된 대동맥 관류 압력과 같은 생리학적 변수 수단도 또한 기록되고 계산되었다. 신생아 준비의 일관성을 보장하기 위해 재관류를 시작하는 데 필요한 시간, 부정맥 지속 시간 및 대동맥 관류 압력과 같은 일부 배제 기준을 고려해야합니다. 관류의 확립 후, 약물 전달, 허혈 - 재관류 손상의 유도, 대사 산물의 변화 또는 심근 세포 분리를위한 효소제의 전달과 같은 개입이 발생할 수 있습니다.
