MycoPatt 방법은 뿌리의 수목 균근 집락에 대한 심층적 인 탐구를 허용합니다. 균근 지도는 곰팡이 확장을 가리키며 각 구조의 실제 위치를 특정 패턴으로 제시합니다. 균근 집락화는 1% 분해능으로 객관적으로 분석됩니다.
각 루트 세그먼트는 자동으로 디지털 매트릭스로 변환되고 식민지화 매개 변수의 광범위한 데이터베이스를 생성합니다. 시작하려면 냉장고에서 뿌리를 제거하고 실온에서 해동하기 위해 작업 플랫폼에 놓습니다. 뿌리 청소를 수행하려면 한 식물의 모든 뿌리를 30-50 밀리리터 병에 넣은 다음 수돗물로 10 % 수산화 나트륨 용액을 준비하고 뿌리를 완전히 덮을 때까지 항아리에 붓습니다.
뿌리에 맑은 용액이 균질하게 분산되도록 항아리를 1-2 분 동안 격렬하게 흔 듭니다. 뿌리가 48 시간 동안 클리어링 용액에 남아 있도록하십시오. 뿌리 헹굼을 위해 항아리의 내용물을 체에 통과시킵니다.
클리어링 용액이 완전히 제거 될 때까지 수돗물로 뿌리를 여러 번 헹굽니다. 다음으로 헹구어 진 뿌리를 깨끗한 병에 넣어 염색하십시오. 그런 다음 수돗물로 5-5 % 잉크 식초 용액을 준비하십시오.
뿌리를 덮을 때까지 항아리에 붓고 1-2 분 동안 흔 듭니다. 부분 염색을 위해 48 시간 후, 얼룩진 뿌리를 수돗물로 1-2 분 동안 헹굽니다. 항아리를 세게 흔들어 여분의 얼룩 용액을 제거하십시오.
현미경 평가를 위해 뿌리가 깨끗해질 때까지 절차를 반복하십시오. 뿌리 분할의 경우 얼룩진 뿌리를 스케일링 된 도마 위에 놓습니다. 뿌리를 1 센티미터 세그먼트로 자릅니다.
각 변형에 대해 15개의 세그먼트를 선택합니다. 다음으로, 세그먼트 준비를 위해 슬라이드에 뿌리를 펼치고 라미네이팅 파우치를 사용하여 뿌리를 덮고 가장자리에서 시작하여 부드럽게 분쇄하십시오. 부드러운 플라스틱 도구를 사용하여 슬라이드에 뿌리를 표시합니다.
라미네이팅 파우치를 조심스럽게 제거하고 커버 슬립으로 샘플을 덮습니다. 피펫으로 슬라이드 모서리에 물을 넣고 물이 슬라이드에 천천히 퍼지도록하십시오. 종이 타월로 여분의 물을 제거하십시오.
현미경 분석을 위해서는 해상도가 좋은 카메라가 장착 된 현미경을 사용하십시오. 말단에서 시작하여 슬라이드를 분석합니다. 각 미세한 필드를 캡처합니다.
두꺼운 뿌리에는 10 또는 40x 배율을 사용하고 얇은 뿌리에는 40x 배율을 사용합니다. 캡처 후 루트 파트의 실제 조립을 허용하는 코드로 각 이미지의 이름을 바꿉니다. 프리젠 테이션 소프트웨어를 사용하여 이미지 조립을위한 드로잉 보드를 디자인하고 너비를 이미지 너비보다 2-3 센티미터 넓게 설정하십시오.
15장의 사진을 캡처한 후 한 세그먼트에서 캡처한 모든 이미지를 1부터 15까지 캡처 순서대로 추가하고 루트 세그먼트의 전체 길이를 재구성합니다. 그런 다음 수직 정렬을 사용하여 이미지를 중앙에 정렬하고 각 이미지가 이전 이미지를 따르는지 확인합니다. 전체 루트 세그먼트를 덮기 위해 모든 그림에 10 x 150 셀의 격자를 배치합니다.
또한 각 그림과 이 격자의 모든 셀에 10 x 10 격자를 배치하고 수막 균근 또는 AM 구조가 보이는 경우 1에서 6까지의 숫자를 삽입하고 AM 구조가 없는 경우 비워 둡니다. 너비가 10셀이고 길이가 150셀인 그리드에 대한 표를 추가합니다. 치수가 있는 표를 이미지의 너비로 변경한 다음 모든 이미지를 포함하도록 표의 길이를 변경합니다.
균근 집락화를 채점하려면 고유 번호를 사용하여 균근 패턴 방법에 설명된 대로 각 유형의 구조에 점수를 매깁니다. 균사에 1 개, arbuscules에 2 개, 소포에 3 개, 포자에 4 개, 보조 세포에 5 개, 진입 점에 6 개를 사용하십시오. 이전에 적용된 그리드의 각 세포에서 관찰된 각 균근 구조에 점수를 매깁니다.
채점 후 얻은 모든 점수를 MycoPatt 스프레드시트에 삽입합니다. 복사 붙여넣기 기능을 사용하여 프레젠테이션의 모든 점수를 Raw Data라는 첫 번째 시트로 전송합니다. 기본 분석의 경우 매개 변수라는 세 번째 시트를 사용하여 결과를 세 가지 형식으로 개별적으로 백분율로 시각화합니다.
A열부터 K열까지 사용하여 식민지화의 수평 이미지를 분석하고, M에서 W 열을 사용하여 식민지화의 수직 이미지를 분석하고, Y 열에서 AI를 사용하여 15 10 x 10 제곱 각각에 대한 횡단 식민지화와 최종 평균 식민지화를 분석합니다. 다음으로, 각 매개 변수와 관련된 정의와 수식을 적용합니다. 균근 지도의 생성 및 추출을 위해 균근 구조 코드를 Graphs라는 두 번째 시트의 색상으로 변환하여 얻은 이미지를 시각화합니다.
그런 다음 그래프 시트의 결과 이미지를 이미지로 내보내고 범례의 색상 코드를 사용하여 균근 패턴을 분석합니다. 균근 지도 분석을 위해 가장 중요한 구조와 그 집합을 식별합니다. 그런 다음 분석된 뿌리에서 관찰된 균근 집락화 패턴을 설명한 다음 뿌리에서 관찰된 구조적 발달, 분기 패턴 및 수목 소포 발달을 기반으로 한 집락화 전략을 설명합니다.
이 프로토콜은 균근 구조와 Zea mays 및 Festal rubra의 뿌리 세포 사이의 좋은 대비와 함께 균근 구조의 세부 사항을 제공합니다. 실패한 제거 및 염색 절차로 인해 Festal rubra 및 Zea mays에서 균근 구조의 불분명 한 현미경 이미지가 생성되었습니다. 균근 식민지화 패턴은 식민지화 메커니즘의 완전한 탐구를 허용했으며, 이 방법은 식민지화 매개변수의 추가 시각적 표현과 함께 Zea mays 및 Festuca rubra에 대한 식민지화 패턴 및 전략에 대한 심층적이고 작은 규모의 탐색을 제공합니다.
Zea mays에서는 식물의 발달 단계에 따라 매우 변동하는 식민지화 잠재력이 관찰되었지만 Festuca rubra에서는 뿌리 내부에서 식민지화 과정이 일어나고 균사 네트워크의 발달은 뿌리의 낮은 발달 속도와 상관 관계가 있습니다. MycoPatt는 모든 식물에서 수목 균근 집락을 매핑하는 데 적합합니다. 식민지화 메커니즘을 완전히 탐구하고 뿌리를 따라 곰팡이 전략을 평가하는 것도 도움이됩니다.
