터널링 나노 튜브 특이 적 마커의 부족은 현장에서의 진행을 제한하고 터널링 나노 튜브를 식별, 특성화 및 정량화하는 방법에 대한 요구가 증가하고 있습니다. 자동 검출 방법은 알고리즘을 개발하거나 기존 알고리즘을 변경할 수 있는 전문 지식 없이는 구현하기 어렵지만 수동 방법은 더 정밀하게 구현하기 쉽습니다. 터널링 나노 튜브를 통한 장거리 세포 간 전달은 신경 퇴행성 병리학, 바이러스 확산 및 암을 포함한 다양한 질병 모델에서 여러 가지 방식으로 구현됩니다.
따라서 병인에서의 역할을 이해하기 위해 나노 튜브 터널링에 대한 연구가 중요합니다. 염색 과정에서 터널링 나노 튜브가 파손될 수 있습니다. 커버 슬립을 사용하거나 슬라이드에 장착하지 말고 대신 유리 바닥 이미징 접시를 사용하십시오.
수정 된 고정 프로토콜은 터널링 나노 튜브를 그대로 유지하는 데 도움이됩니다. 절차를 시연하는 것은 Sangeeta NAF 실험실의 박사 과정 학생 인 Deepak KV가 될 것입니다. 시작하기로, 대조군 및 올리고머 A-베타 처리된 세포를 고정 전에 2분 동안 PBS로 2회 세척한다.
pH 7.2의 0.1 몰 인산염 완충액에 용해 된 2 % 포르말린 정착액과 2.5 % 글루 타르 알데히드를 사용하여 Karnovsky의 고정 용액을 준비하십시오. 그런 다음 Karnovsky의 고정 용액을 실온에서 45 분 동안 추가하여 이미징 접시에 세포를 고정시킵니다. 5 밀리리터의 FBS에 0.1 그램의 사포닌을 용해시켜 배양 완충액을 제조하고 95 밀리리터의 PBS를 첨가하여 희석한다.
그 후 고정된 세포를 2분 동안 배양 완충액을 사용하여 2회 세척한다. 고정 후, phospho-PAK1에 대한 첫 번째 항체를 추가하고, 인큐베이션 완충액에 1 내지 250의 희석물을 첨가하고, 어둡고 습한 챔버에서 섭씨 4도에서 밤새 배양한다. 다음날 24 시간 배양 후, 배양 완충액으로 세포를 2 분 동안 두 번 세척한다.
그런 다음 Alexa Fluor 488 및 Phalloidin 555에 접합 된 2 차 항체를 추가하십시오. 세포를 실온에서 1.5 시간 동안 어둡고 습한 챔버에서 배양한다. 인큐베이션 후, 세포를 2분 동안 인큐베이션 완충액으로 2회 세척한다.
1 내지 2000 희석액의 DAPI를 첨가하여 핵을 염색하고 암실에서 실온에서 5 내지 10분 동안 배양한다. 90% 글리세롤 및 10% PBS에서 25mg의 DABCO를 사용하여 DABCO 장착 매체를 준비합니다. 적절하게 용해하려면 분광 광도계 등급의 묽은 염산을 사용하여 pH를 8.6으로 조정하고 혼합을 위해 용액을 로커에 보관하십시오.
표백 방지제로 DABCO 장착 매체를 바닥에 커버 슬립이 포함된 이미징 접시에 직접 추가합니다. 최소 1-2 시간 동안 기다렸다가 직접 컨포칼 이미징을 수행하십시오. 터널링 나노튜브를 식별하려면 먼저 채널을 선택하고 컨포칼 소프트웨어의 창 트랙 1, 트랙 2 및 트랙 3에서 필요한 레이저를 순차적으로 클릭하여 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 면역염색 세포의 Z 스택 이미지를 캡처합니다.
트랙 1 창 아래에 있는 TPMT 옵션을 클릭하여 형광 채널이 있는 미분 간섭 대비 이미지를 촬영합니다. 소프트웨어의 획득 탭을 선택하고 Z 스택 탭을 클릭한 다음 창이 열릴 때까지 기다립니다. 그런 다음 라이브 스캔을 클릭하여 접시 하단의 셀에 초점을 맞춥니다.
초점이 맞춰진 이미지를 첫 번째 스택으로 선택한 다음 셀의 맨 위 부분을 볼 수 있도록 초점을 맞추고 마지막 스택으로 선택합니다. 라이브 스캔을 중지하고 최적 탭 옆에 있는 숫자를 클릭하여 셀 두께를 기준으로 슬라이스 수와 간격을 결정하는 스택의 단계 크기를 수정합니다. 405나노미터, 488나노미터 및 561나노미터 레이저로 DAPI, FITC 및 TRITC의 3개 채널을 순차적으로 촬영하고 1.02마이크로초의 픽셀 체류 시간으로 캡처합니다.
형광 채널이 있는 DIC 채널에서 이미지를 캡처하여 세포 경계를 관찰합니다. 분석을 위해 피지 소프트웨어에서 czi 데이터 형식으로 저장된 공초점 이미지를 엽니다. 하이퍼스택 옵션을 선택하여 이미지의 각 Z 스택 및 채널을 확인합니다.
채널 및 Z 스택 스크롤 막대를 스크롤하여 관심 있는 특정 채널의 정확한 스택을 선택합니다. 그런 다음 먼저 채널 막대를 스크롤하여 F-actin 염색 채널을 선택하고 Z-스택을 수동으로 스크롤하여 각 스택을 하나씩 확인합니다. Z-스택의 하부에서 볼 수 있고 Z가 신경돌기로 2인 이미징 접시의 표면에 가까운 세포를 연결하는 것처럼 보이는 F-액틴 염색 구조를 식별합니다.
터널링 나노 튜브를 식별하고, Z- 스택을 Z에서 4까지 상단으로 스크롤하여 F- 액틴 양성 호버링 세포 대 세포 도관을 식별합니다. 표면을 향한 Z-스택의 아래쪽 부분 근처에서 신경돌기를 찾고 Z-스택이 6인 Z에서 상단으로 스크롤되면서 사라지기 시작하는 것을 관찰합니다. Z-스택에서 도관의 호버링 특성을 분석하여 F-액틴 양성 터널링 나노튜브와 유사하게 phospho-PAK1 포지티브 터널링 나노튜브를 식별합니다.
phospho-PAK1 염색은 F- 액틴 염색보다 약하기 때문에 Z가 4이고 Z가 6 인 phospho-PAK1 염색 터널링 나노 튜브를 찾으십시오. 또한, DIC 이미지를 관찰하여 F-actin 및 phospho-PAK1 염색 터널링 나노튜브 구조가 세포간 막 도관임을 확인하였다. 또한 F- 액틴과 phospho-PAK1 채널을 병합하여 확인 된 터널링 나노 튜브가 F- 액틴 및 phospho-PAK1 공동 염색 구조인지 확인합니다.
터널링 나노 튜브를 정량화하려면 총 세포 수와 확인 된 터널링 나노 튜브를 수동으로 계산하고 숫자를 백분율로 나타냅니다. Z- 스택 이미지에서 호버링 도관과 같은 F- 액틴 및 베타 III 튜 불린 양성 터널링 나노 튜브를 구별하려면 F- 액틴 및 베타 III 튜 불린 채널을 병합 한 다음 병합 된 이미지의 Z 스택을 분석합니다. Z가 3이고 Z가 6이고 Z가 9에서 두드러지는 F- 액틴 염색 터널링 나노 튜브를 찾으십시오.
유사하게, F- 액틴과 베타 III 튜 불린을 확인하십시오. Z에서 6과 같고 Z가 9에 속하는 호버링 도관과 같은 이중 양성 터널링 나노 튜브. Z-스택의 하부에서 다른 F-액틴 및 베타 III 튜불린 염색 비호버링 돌출부를 식별합니다.
피지의 라인 도구를 사용하여 터널링 나노 튜브의 직경을 측정하십시오. 분석을 클릭하여 측정 배율을 확인한 다음 픽셀 단위의 거리가 czi 이미지에서 자동으로 설정되도록 배율을 설정합니다. XY 평면에서 터널링 나노 튜브의 직경을 측정합니다.
3D 재 슬라이싱 및 임계 값 지원 3D 시각화를 허용하는 피지의 볼륨 뷰어 플러그인을 사용하여 Z 스택 이미지를 개별 채널로 분할합니다. 그런 다음 단일 채널 Z 스택 이미지를 잘라 3D 재구성 보기를 사용하여 한 번에 하나 또는 두 개의 터널링 나노튜브 또는 신경돌기를 강조 표시합니다. XY 평면에 단일 터널링 나노 튜브 또는 신경 돌기를 고정하고 XZ 및 YZ 액세스 단면을 표시합니다.
XZ 평면의 하단, XZ 및 YZ 평면의 신경돌기, 상부 Z 스택의 터널링 나노 튜브를 관찰하십시오. 개별 터널링 나노튜브 또는 신경돌기를 선택하여 XZ 평면에서 3D 볼륨 뷰를 재구성합니다. 3D 재구성에서 Z 평면의 바닥에있는 신경 돌기와 바닥 Z 평면을 건드리지 않고 두 세포를 연결하는 호버링 구조로 나타나는 터널링 나노 튜브를 관찰하십시오.
F-액틴 및 포스포-PAK1을 사용한 면역염색 세포의 컨포칼 Z-스택 이미지를 분석하여 터널링 나노튜브를 식별했습니다. 또한, FIC 이미지를 분석하여 F-actin 및 phospho-PAK1 염색 터널링 나노튜브 구조가 세포 사이의 막 도관임을 확인하였다. 세포를 F-액틴과 베타 III 튜불린으로 이중면역염색하였고, 터널링 나노튜브형 F-액틴과 터널링 나노튜브 형상의 F-액틴 및 베타III 튜불린 이중 양성 막 도관은 F-액틴 양성 터널링 나노튜브만을 구별하였다.
phospho-PAK1 및 F- 액틴과 함께 발현 된 터널링 나노 튜브는 지층을 건드리지 않고 두 세포 사이를 맴도는 특성을 기반으로 3D 체적보기 이미지를 구성하여 다른 신경 돌기의 세포 돌출부와 구별되었습니다. 샘플의 불완전한 고정은 표적 단백질의 빠른 단백질 분해 분해 및 특정 면역 반응성의 감소로 이어질 수 있으므로 올바른 고정제의 사용이 중요합니다.
