이 프로토콜은 원래 린다 벅의 연구실에서 Xiaolan 예와 마이클 Petrascheck에 의해 시애틀에서 프레드 허치슨 암 연구 센터에서 개발되었습니다. 위의 자세한 버전은보다 넓은 지역 사회에 사용할 수있는 모든 절차를 준비하고 있습니다. 우리는 비판적 프로토콜을 읽기위한 캐롤 테일러, 사라 르뵈프와 앤디 Tomacelli 감사드립니다. 이것은 스크립스 연구소에서 원고 # 2866입니다. Petrascheck 연구소는 노바티스 ADI 프로그램에 의해 자금입니다.

개요 : 프로토콜은 네 부분으로 나뉩니다. 파트 1은 먹이 박테리아를 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 파트 2 웜 문화를 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 3 부에서는 수명을 점수하는 방법에 대해 설명합니다. 4 부에서는 몇 가지 대표적인 결과를 보여줍니다, 그리고 제 5 부에 필요한 솔루션을 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 수명 실험을 완료하는 데 몇 주가 걸릴. 프로토콜 주간의 각 단계에 대한, 일, 그리고 하루의 시간 계획을 용이하게하기 위해 포함됩니다. L4 단계 (데이 0) 전체 프로토콜에 대한 참조 포인트로 사용됩니다. 1. 수유 박테리아의 준비 이 섹션은 먹이 박테리아의 준비에 대해 설명합니다. 특정 E. 대장균은 OP50라고 C.elegans를 공급하는 데 사용되는 변형. 다른 박테리아와 웜 문화의 교차 오염을 방지하기 위해이 프로토콜을하기 전에, OP50 변형이 Carbenicillin / 암피실린 저항 21하였습니다. 사전에 OP50 4~5일를 준비합니다. OP50과 연락 오는 모든 자료는 멸균해야합니다. 일 -7 : 목요일 (주 1) : 접종 37 박 이상의 단일 OP50 식민지와 부화 ° 세균 통에 C 100 μg / ML 암피실린 및 0.1 μg / ML Amphotericin B를 포함하는 TB 5 ML. 일 -6 : 금요일 (주 1). 아침 8시 반. 문화 충분한 시간이 포화에 도달하도록 초기 접종 <ol><li> 50 μg / ML 암피실린을 포함한 300 ML의 TB에서 OP50 1:2000의 야간 문화를 희석. 채도에 도달할 때까지 37 8~12시간에 대한 세균 쉐이크 ° C의 문화를 품다. 문화 14 시간 이상 성장을 허용하지 않습니다. </li><li> 멸균, 사전에 가중치 원심 분리 관에 OP50을 전송합니다. 펠렛 테이블 톱 원심 분리기에서 3,500 RPM (2,200 XG) 10 분 원심 분리하여 OP50. </li><li> 뜨는을 취소하고 멸균 물 속에 다시 중지 OP50 펠렛하고 다시 원심 분리하여 펠렛. 두번 세척을 반복합니다. </li><li> 두 번째 세척 후, 모든 남아있는 물을 조심스럽게 제거합니다. 물도은 튜브에 남아되지 않을 것입니다. 펠렛을 포함하고있는 원심 분리 튜브를 저울질하고 펠렛의 무게를 결정하기 위해 비어있는 원심 분리 관의 무게를 뺍니다. </li><li> 철저히 100 MG / ML의 농도 S - 완료의 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 아무도 대단히 짧은 시간을 둘 수 없습니다. </li><li> 100 MG / ML OP50의 농도는 2 X10 10 세균 / ML에 해당한다. ML 당 박테리아의 광학 밀도와 숫자 사이의 관계가 알려져있다면 ML 당 박테리아의 수를 결정하는 사​​진 분광계를 사용하십시오. 필요한 경우, 2 X10 10 세균 / ML에 OP50 먹이 솔루션의 농도를 조정합니다. </li><li> 4 OP50solution를 저장 °가 웜 문화에 사용되는 C까지. </li></ol> 2. 동기 웜 문화의 준비 이 섹션은 웜 문화의 준비에 대해 설명합니다. 그 목표는 벌레의 시대 - 동기 인구를 생성하는 것입니다. 5 단계에서 표백제 치료 후 C.elegans와 연락 오는 모든 자료는 멸균해야합니다. 플레이트는 별도로 표시 ° C 않는 20 보관됩니다. 일 -6 : 금요일 (주 1), 오후 4 오후 : 새로운 접시에 동물을 전송 <ol><li> 웜 인구의 대다수가 굶어 죽었을 L1의 애벌레로 구성되어있는 5-10일 오래된 NGM 판을 가져가라. </li><li> 곧 알콜 램프를 통해 그것을 가열하여 금속 주걱을 소독. 그것은 식지. 굶주린 벌레가 들어있는 접시에서 한천 덩어리를 잘라 냉각 주걱을 사용합니다. OP50와 신선한 10cm NGM 판에 씨앗이 덩어리 몇 가지를 전송합니다. 약 품어. 웜 인구의 대부분 gravid 성인 구성되어 ° C까지 20 65시간. 그것이 gravid 성인으로 성장하기 위해 굶어 L1 동물을위한 소요 시간은 변형의 변형에 따라 다를 수 있습니다. </li></ol> 주 -3 : 월요일 (주 2) 오전 10:00 : 동기 인구를 설정 <ol start="3"><li> 50-10 ML 멸균 물을 접시 그들을 세척하여 10cm 접시에서 벌레를 수집합니다. 15 ML 원뿔 관에 웜 / 물 솔루션을 전송합니다. </li><li> 1,200 RPM (280 XG)에서 탁상 원심 분리기 2 분 centrifuging하여 벌레를 씻으십시오. 뜨는을 취소하고 10 ML 물을 추가합니다. 반복합니다. </li><li> 뜨는 제거하고 신선한 표백 / NaOH 용액 (2.5 ML 가정용 표백제, 1 ML 10N NaOH, 6.5 ML H 2 O) 5 ML를 추가합니다. 벌레가 열려 휴식까지 RT에서 5 분 동안 품어. 부드럽게 와동 모든 분하시기 바랍니다. 해부 현미경 반응의 진행 상황을 모니터링합니다. </li><li> 즉시 모든 어른 디졸브로 반응을 무력화 M9 버퍼의 5 ML를 추가합니다. </li><li> (2,500 RPM에서 2 분 centrifuging 10 ML M9 버퍼와 달걀 세 번 씻어1,100 XG). </li><li> 한번와 계란을 씻어 10 ML 2,500 RPM (1,100 XG) 2 분 centrifuging하여 S - 완료되었습니다. </li><li> 뜨는 제거를 추가, 10 ML S는 - 완전하고 신선한 50 ML 원뿔 관에 대한 해결책을 전송합니다. 40 ML의 최종 볼륨 S - 완성 30 ML을 추가합니다. 부드럽게 nutator 또는 이와 유사한 장치에 실온에서 하룻밤 튜브를 흔들. </li></ol> 일 -2 : 화요일 (주 2) 12:00 : 접시에 종자 동물 <ol start="10"><li> 해부 현미경, 벌레가 밤 동안 부화 여부를 확인하십시오. 해부 범위를 사용하여 10 μL 방울의 벌레의 수를 계산하여 S - 완벽한 솔루션에 벌레의 농도를 결정합니다. 각 샘플에 대해 적어도 10 방울을 계산합니다. </li><li> 80-100 웜 / S 완성에 ML의 농도에있는 벌레를 다시 일시 중지합니다. 0.1 μg / ML의 최종 농도 50 μg / ML과 Amphotericin B (재고 250 μg / ML)의 최종 농도 Carbenicillin을 (재고 100 MG / ML) 추가합니다. nutator 악수. 벌레의 큰 수량을 준비하면, 필터 캡과 함께 600 ML의 nunclon 플라스크를 사용합니다. </li><li> 오후 2시 반 6 MG / ML (= 1.2 X10 9 세균 / ML)의 최종 농도 1 부에서 준비한 OP50를 추가합니다. OP50 4 ° C.로 돌아가기 </li><li> 96 잘 접시의 각 우물에 worm/OP50 솔루션을 120 μL을 전송합니다. 투명한 바닥과 96 잘 접시를 사용합니다. pipetting 동안 정지에있는 벌레를 유지 있는지 확인하십시오. </li><li> 오염 및 증발을 방지하기 위해 테이프 실러를 사용하여 번호판을 밀봉합니다. 2 분 microtiter 접시 쉐이크에 접시를 흔들 동물 L4 단계에 도달할 때까지 20 이일 ° C에 대해 숙고하다. </li></ol> 일 0 : 목요일 (주 2) 정오가 : Fluorodeoxyuridine을 추가하여 동물을 소독 (FUDR) <ol start="15"><li> 동물이 각각 잘 수있는 0.6 MM의 FUDR 주식 솔루션 30 μL를 추가 소독합니다. 이 단계는 150 μL 각 우물에 최종 볼륨을 제공 5 MG / ML (1x10 9 세균 / ML)에 6mg / ML에서 OP50의 최종 농도를 감소시킵니다. 테이프 실러스를 사용하여 번호판을 봉인하고 microtiter 접시 쉐이크에서 2-3 분 흔들어. OP50이 일 -2에서 2시 30 분에 추가되었습니다면, 그것은 FUDR은 정오 전에 추가하는 것이 중요합니다. 20 ° C 배양기에 플레이트로 돌아가기 </li></ol> 1 일 : 금요일 (주 2) : 문화에 약물을 추가 <ol start="16"><li> 오전 9함으로써 동물의 대부분 gravid 여러 계란 각을 포함해야합니다. 누구의 영향 수명에 원하는 농도에서 테스트하는 약물을 추가합니다. DMSO에 마약을 분해하는 경우 DMSO의 최종 농도는 0.6 %가 C.elegans 수명을 단축보다 DMSO의 농도 높은 같은 0.6 %를 초과해서는 안됩니다. 약물 이외 후, 테이프 실러와 접시를 봉인하고 microtiter 접시 쉐이크에서 2-3 분 흔들어. 20 ° C 배양기에 플레이트로 돌아가기 </li><li> 마약를 추가하면 때때로, 특히 물보다 용매의 다른을 사용하는 경우, 접시 당 몇몇 동물을 죽일 수 있습니다. 죽은 동물을 확인하는 거꾸로 현미경을 사용합니다. 일반적으로, 96 잘 접시 당 미만 10 죽은 동물이 있어야합니다. 20 ° C 배양기로 번호판을 반환합니다. </li></ol> 일 4 : 월요일 (주 3) : 변경 실러스 <ol start="18"><li> 실러를 제거 문화를 입력 신선한 산소를 허용하려면, 일분 후에 접시를 봉인. microtiter 접시 쉐이크에 2-3분에 대한 번호판을 흔들어. 매주 한 번 반복합니다. </li></ol> 제 5 일 : 화요일 (주 3) : 기아를 방지하기 위해 새로운 OP50 추가 <ol start="19"><li> 기아를 방지하기 위해 96 우물의 각 부분 1 준비했습니다 100 MG / ML OP50 솔루션의 5 μL를 추가합니다. </li></ol> 3. 수명의 점수. 이 섹션은 동물들이 죽을때까지 제 2의 동기 웜 인구의 생존을 감시하는 방법을 설명합니다. 96 잘 접시에있는 동물을 관찰하려면, 2X 또는 2.5x 목적으로 거꾸로 현미경을 사용합니다. 기록 생존 데이터를 일주일에 세 번, 월요일, 수요일, 금요일. 동물이 살아 있거나 죽어있는지를 확인하기 위해 움직임을 사용합니다. 강한 빛, 특히 푸른 불빛이 이동하는 동물을 유도. 분석에서 죽은 동물을 제거하지 마십시오. 때로는 움직이지 않았고 앞의 수가 죽은 결정 동물은 나중에 이동 할 수도 있습니다. <ol><li> 일 0에, 실험의 시작 부분에 각 우물에 벌레의 총 수를 계산합니다. 이 우물의 동물로 분석에서 이상의 18 동물을 포함 우물을 검열 충분 OP50이되지 않으며식이 제한의 효과를 보여줍니다. </li><li> 동물 2 분 microtiter 접시 쉐이크에 96 접시를 잘 흔들어 이동하는 기회를 증가하기 위하여. 전에 계산. </li><li> 각 계수 세션 기록 날짜 및 동물의 수가 어느살아있는 동물로 이동합니다. 액체의 운동은 단단한 미디어에보다 쉽게​​하고 강한 조명에 의해 유도된 수 있습니다. 높은 배율의 사용은 인두의 끝을 분들처럼 매우 미묘한 움직임을 탐지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 미묘한 움직임은 종종 아주 오래된 동물 관찰 유일한 운동입니다. </li><li> 20 ° C 배양기에 플레이트로 돌아가기 </li><li> 모든 동물이 죽을 때까지 2~3일마다 2-4 단계를 반복합니다. </li></ol> 4. 대표 결과. 이 섹션에서는이 분석과 몇 가지 대표적인 결과에 의해 생성되는 수명 데이터의 기록을 유지하는 방법에 대한 예제를 보여줍니다. 그림 1A는이 분석하는 동안 수명 데이터를 기록하는 방법에 대한 예제를 보여줍니다. 엑셀 시트는 생존 각 우물에 인구를 추적하는 데 사용됩니다. 각 잘 들어 그것이 몇달이 좌표의, 스트레인, 마약, 약물의 농도와 일 0에 살아있는 동물의 총 개수는 (X0) 실험의 시작 부분에 기록됩니다. 기록 날짜뿐만 아니라 생활과 죽은 동물의 수를 세 번 각각 잘의 다양한 인구의 생존을 수행하기 위해 주. 그래프 결과를 위해, 매일 매일 살아있는 동물의 분율을 계산하고 일 시간의 함수로 플롯. P - 값은 스타타 또는 이와 유사한 소프트웨어와 같은 통계 패키지를 사용하여 계산해야합니다. C.elegans의 매체 수명은 온도에 따라 달라집니다. 그림 1B는 수명의 온도 종속 변경 사항이 정확하게 수명 분석 22 기반 microtiter에 의해 복제되는 보여줍니다. 마찬가지로, microtiter 플레이트 분석 야생 타입 N2 동물 23-24 25 (그림 1C)에서 다를 lifespans을보고 돌연변이에서 수명의 변화를 재현한. 분석은 또한 더 많은 양적 진술을하기 위해 사용할 수 있습니다. Fig1D의 의미에서 수명이 Mirtazepine 농도 7 기능으로 꾸몄다 있습니다. 각 데이터 포인트는 7-12 인구의 평균 수명, 잘 다른 각 생활을 나타냅니다. 잘마다 동물의 숫자 (5-15 동물) 비교적 낮은 경우에도 오차 막대에서 볼 수 있듯이 잘 - 투 - 잘 편차는 상대적으로 작다. <img src="/files/ftp_upload/2496/2496fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 수명 분석을 기반으로 microtiter 플레이트 정확하게 수명의 변화에 문헌에 보고된를 재현한. (A) 샘플 데이터는 Excel 스프레드 시트에서 수집했습니다. 각 계수 세션 날짜 동안 잘의 좌표와 살고 죽은 동물의 숫자를 기록했다. 실험의 시작 부분에서, 각 우물에 동물의 총 개수가 결정되었습니다. (B) 야생 유형의 생존 곡선 (N2) 동물 20 성장 ° C와 25 ° C. 수명에 영향을 변이를 들고 종자의 (C) 서바이벌 곡선. 네개의 변종은 20 ° C.에 병렬로 assayed되었습니다 Mirtazepine 취급 N2 동물 (D) 선량 반응 곡선. 평균 수명은 Mirtazepine 농도의 함수로 꾸몄다 있습니다. 오류 막대는 조건 1 일 8 웰스의 SEM을 나타냅니다. 5. 자료. M9 버퍼, 1000 ML <ul><li> 6g 나 2 HPO 4 </li><li> 3g KH 2 PO 4 </li><li> 5g NaCl </li><li> 0.25 g MgSO 4 7H 2 O ∙ </li><li> 1000 ML에 탈이온수 추가 </li><li> 압력솥 </li></ul> Potassiumphosphate 버퍼 산도 6.0 1000 ML <ul><li> 136g KH 2 PO 4 </li><li> 900 ML에 탈이온수 추가 </li><li> 5M 코와 6.0 산도를 조정 </li><li> 1000 ML에 탈이온수 추가 </li><li> 압력솥 </li></ul> 추적 금속 솔루션 <ul><li> 1.86 g 나이 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </li><li> 0.69 g FeSO 4 7H 2 O ∙ </li><li> 0.20 g MnCl 2 ∙ 4H 2 O </li><li> 0.29 g ZnSO 4 7H 2 O ∙ </li><li> 0.016 g CuSO 4 </li><li> 1000 ML 물을 deionized </li><li> 압력솥과 어둠 속에 저장합니다. </li></ul> S - 기초 중간, 1000 ML <ul><li> 5.9 g NaCl </li><li> 1M 칼륨 나트륨, 산도 6.0의 50 ML </li><li> 1000 ML 물을 deionized </li><li> 압력솥 </li><li> 5mg / ML 콜레스테롤 (잇 - OH에 용해) 1 ML을 추가합니다 다음 솔루션은 식지합니다. </li></ul> 칼륨 구연 산염의 1M 1000 ML <ul><li> 268.8 g의 tripotassium의 구연 산염 </li><li> 26.3 구연산 산성 일수화물 </li><li> 900 ML 탈이온수 추가 </li><li> 5M 코와 6.0 산도를 조정 </li><li> 1000 ML에 탈이온수 추가 </li><li> 압력솥 </li></ul> S - 완료 중간, 1000 ML <ul><li> 977 ML S - 기저 </li><li> 10 ML 1M 칼륨의 구연 산염의 산도 6 (살균) </li><li> 10 ML 트레이스 금속 용액 (살균) </li><li> 3 ML 1M CaCl 2 (살균) </li><li> 3 ML 1M MgSO 4 (살균) </li></ul> NGM의 한천 <ul><li> 3.0g NaCl </li><li> 2.5G Pepton(카제인에서 췌장 소화) </li><li> 17g 아가르 </li><li> 탈이온수 975 ML과 감동 바 추가 </li><li> 압력솥 </li><li> 55 식다 autoclaving 후에 ° C 다음과 같은 구성 요소를 추가합니다 : <ul><li> 1M CaCl 2 (멸균)의 0.5 ML </li><li> 에탄올의 5mg / ML 콜레스테롤 1 ML </li><li> 1M MgSO 4 (멸균) 1 ML </li><li> 25 ML의 Potassiumphosphate 버퍼, 산도 6.0 (멸균) </li></ul></li></ul> TB 1000 ML <ul><li> 12g Bacto Tryptone </li><li> 24g의 효모 추출 </li><li> 4 ML의 글리세롤 </li><li> 900 ML 탈이온수 추가 </li><li> 압력솥 </li><li> 55 식다 autoclaving 후에 ° C 다음과 같은 구성 요소를 추가합니다 : <ul><li> 0.17M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 100 ML을 추가 </li></ul></li></ul> 0.6 MM Fluorodeoxyuridine (FUDR, 시그마 고양이 # F0503), 1000 ML <ul><li> 100 MG FUDR </li><li> S - 완전 무균 670 ML에 용해, 10 ML 45 ML aliquots합니다. </li><li> -20 ° C.에 저장 </li></ul> 100 MG / ML Carbenicillin, 10 ML <ul><li> 1g Carbenicillin </li><li> 10 ML 무균 탈이온수 </li><li> 무균 여과액 및 나누어지는 </li><li> -20 ° C.에 저장 </li><li> 50 μg / ML의 최종 농도에서 사용 </li></ul> 250ug / ML Amphotericin B, 4 ML <ul><li> 1mg Amphotericin B </li><li> 4 ML 잇 - OH </li><li> -20 ° C에서 보관 </li><li> 0.1 μg / ML의 최종 농도에서 사용 </li></ul>

<ol>
	<li>Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+life-span+of+age-1+mutants+in+Caenorhabditis+elegans+and+lower+Gompertz+rate+of+aging.">Increased life-span of age-1 mutants in Caenorhabditis elegans and lower Gompertz rate of aging.</a> Science. 249, 908-912 (1990).</li><li>Kenyon, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+ageing.">The genetics of ageing.</a> Nature. 464, 504-512 (2010).</li><li>Finch, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+aging.">The genetics of aging.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 2, 435-462 (2001).</li><li>Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blueberry+polyphenols+increase+lifespan+and+thermotolerance+in+Caenorhabditis+elegans.">Blueberry polyphenols increase lifespan and thermotolerance in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 5, 59-68 (2006).</li><li>Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticonvulsant+medications+extend+worm+life-span.">Anticonvulsant medications extend worm life-span.</a> Science. 307, 258-262 (2005).</li><li>McColl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacogenetic+analysis+of+lithium-induced+delayed+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Pharmacogenetic analysis of lithium-induced delayed aging in Caenorhabditis elegans.</a> J. Biol. Chem. 283, 350-357 (2008).</li><li>Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antidepressant+that+extends+lifespan+in+adult+Caenorhabditis+elegans.">An antidepressant that extends lifespan in adult Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 450, 553-556 (2007).</li><li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reserpine+can+confer+stress+tolerance+and+lifespan+extension+in+the+nematode+C.+elegans.">Reserpine can confer stress tolerance and lifespan extension in the nematode C. elegans.</a> Biogerontology. 9, 309-316 (2008).</li><li>Wood, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sirtuin+activators+mimic+caloric+restriction+and+delay+ageing+in+metazoans.">Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans.</a> Nature. 430, 686-689 (2004).</li><li>Evason, K., Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valproic+acid+extends+Caenorhabditis+elegans+lifespan.">Valproic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan.</a> Aging Cell. 7, 305-317 (2008).</li><li>Onken, B., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+induces+a+dietary+restriction-like+state+and+the+oxidative+stress+response+to+extend+C.+elegans+Healthspan+via+AMPK,+LKB1,+and+SKN-1.">Metformin induces a dietary restriction-like state and the oxidative stress response to extend C. elegans Healthspan via AMPK, LKB1, and SKN-1.</a> PLoS One. 5, e8758-e8758 (2010).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+increases+stress+resistance+and+extends+life+span+of+Caenorhabditis+elegans.">Ginkgo biloba extract EGb 761 increases stress resistance and extends life span of Caenorhabditis elegans.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 48, 725-731 (2002).</li><li>Kang, H. L., Benzer, S., Min, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+extension+in+Drosophila+by+feeding+a+drug.">Life extension in Drosophila by feeding a drug.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 838-843 (2002).</li><li>Avanesian, A., Khodayari, B., Felgner, J. S., Jafari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamotrigine+extends+lifespan+but+compromises+health+span+in+Drosophila+melanogaster.">Lamotrigine extends lifespan but compromises health span in Drosophila melanogaster.</a> Biogerontology. 11, 45-52 (2010).</li><li>Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+of+life-span+with+superoxide+dismutase/catalase+mimetics.">Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics.</a> Science. 289, 1567-1569 (2000).</li><li>Benedetti, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+that+confer+thermal+stress+resistance+and+extended+lifespan.">Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan.</a> Exp. Gerontol. 43, 882-891 (2008).</li><li>Braungart, E., Gerlach, M., Riederer, P., Baumeister, R., Hoener, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+MPP++model+of+Parkinson's+disease+for+high-throughput+drug+screenings.">Caenorhabditis elegans MPP+ model of Parkinson's disease for high-throughput drug screenings.</a> Neurodegener Dis. 1, 175-183 (2004).</li><li>Kwok, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist.">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441, 91-95 (2006).</li><li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screen+for+novel+antimicrobials+using+a+whole+animal+infection+model.">High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model.</a> ACS Chem Biol. 4, 527-533 (2009).</li><li>Kaletta, T., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+function+in+novel+targets:+C.+elegans+as+a+model+organism.">Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism.</a> Nat Rev Drug Discov. 5, 387-398 (2006).</li><li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli:+transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution.">One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 2172-2175 (1989).</li><li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span.">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech. Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li><li>Ailion, M., Inoue, T., Weaver, C. I., Holdcraft, R. W., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosecretory+control+of+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7394-7397 (1999).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li><li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+life-span+in+Caenorhabditis+elegans+by+four+clock+genes.">Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes.</a> Science. 272, 1010-1013 (1996).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

제시 프로토콜 96 잘 microtiter 접시에 C.elegans 수명의 측정을하실 수 있습니다. 으로 대표 결과에 표시된 섹션은 안정적으로 이전 결과를 복제 및 양적 정보를 제공합니다. 이 분석을 사용 우리는 성공적으로 C.elegans 수명에 대한 그들의 영향에 대한 89,000 분자 이상 검사를했습니다. 약물 검사의 목적을 위해, 96 잘 microtiter 플레이트 형식의 수명을 측정하는 것은 전통적인 고체 미디어 분석을 통해 몇 가지 장점이 있습니다. 그것은 미디어 준비, 보육 공간, 그리고 필요한 약물의 양을에 필요한 노동을 줄일 수 있습니다. 96 - 웰 형식과 현미경 설정은 높은 처리량 검사에 대한 전체 분석의 자동화를 허용합니다. 분석의 개발 기간 동안 각 변수와 조합에 대해 여러 개의 값이 그에 C.elegans 수명에 미치는 영향에 대해 테스트되었습니다. 이 테스트는 3에서 10에 이르기까지 다양한 OP50 농도를 포함 MG / ML (3, 4, 6, 8, 10 MG / ML), 7에서 45 (7, 10, 15, 22, 45에 이르기까지 잘 따라 웜의 다른 번호 웜 / 음), 40에서 150 잘마다 μL (40, 60, 80, 100, 120, 150 μL), 그리고 버퍼 구성의 변화에​​ 이르기까지 다양한 문화 볼륨. 먹은 경우 Carbenicillin 방지 OP50와 농도에 Carbenicillin이나 Amphotericin B도가 표시가 C.elegans 수명에 영향을 찾았습니다. 접시의 지속적인 완만한 떨고, 자주 C.elegans 액체 문화에 추천합니다,이 분석에 사용되는 작은 볼륨 소모품 발견되었습니다. 큰 우물과 microtiter 접시가 사용할 수있다면 부드러운 흔들림는하지만 필요합니다. 값은이 프로토콜에 신중하게 테스트를 다양한 조건의 통계 비교에 따라 선택되어 지적했다. 이 분석의 가장 놀라운 특징은 아마 C.elegans은 테이프로 봉인된 96 잘 접시에 보관 수있다는 사실이다. 나란히 비교는 비닐 실러와 함께 밀폐 접시, 또는 공기의 교환을 허용 실러스와 밀폐 접시에 unsealed 접시에 교양 동물의 수명에 차이를 공개하지 않았다. 세 조건에서 동물 L1에서 65시간 이내 gravid 어른 매우 homogenously 개발하고 매우 유사한 lifespans을 보여주었다. NGM에 병렬로 성장 동물이 약간 더 빠른 개발,하지만이 차이는 실러의 부재 또는 존재 독립했다. 제시 프로토콜은 라이브 세균을 기반으로하지만, 죽은 박테리아에 대한 적응하실 수 있습니다. 그러나, 액체 분석에서 하나의 생존 박테리아는 빠르게 증식하고 문화를 다시 채웁니다. 우리 손에, 그들은 액체 문화 사용할 수있는 범위 내에서 세균을 죽일 수있는 유일한 안정적인 방법은 감마 방사선으로 박테리아의 연장 치료를하는 것입니다. 수명 실험의 계획에 고려해야 할 한 가지 중요한 포인트는 감지의 능력이 있습니다. 효과의 크기에 따라, 관심있는 약물의 영향은 여러 우물에서 테스트해야합니다. 전형적인 분석 4 약물 치료 4 제어 우물, 해당 대략하기 40-50 각 동물에서 실험 이상의 95%의 수명에서 3​​0 % 증가를 감지하기 위해 충분해야합니다. 14 % 증가는 사건의 60 %에 감지하고 따라서 더 많은 복제 우물을 필요로하고 있습니다. 이 분석에 의해 생성된 수명 데이터의 풍부한는 실험을 개발하거나 특정 parametrical Gompertz 모델 1 변형하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 Gompertz 모델은 검색의 힘을 확인하고 대규모 스크린에 대한 잘못된 반응과 네거티브 필름의 수를 추정하는 데 유용합니다. 우리는 장님이 실험에서 이러한 모델의 예측을 검증하고 대형 스크린에서 거짓 네거티브 필름의 숫자 (게시되지 않은 결과를) 측정에 사용. 요약, 우리는 제시 분석은 C.elegans의 수명을 연장하고 기본 메커니즘을 연구하는 작은 분자를 식별하는 큰 도움이 될 것으로 예상.

A correction to the article Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates was made.

Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Amphotericin B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>cat# 171375</td>
<td>Also called Fungizone</td>
</tr>
<tr>
<td>FUDR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>cat# F0503</td>
<td>FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water</td>
</tr>
<tr>
<td>Mianserin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>M2525-250MG</td>
<td>Use as positive control at 50&mu;M final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyproheptadine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>cat#C6022-MG</td>
<td>Alternative positive control at 10 &mu;M final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Sealing Tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>cat# 236370</td>
<td>Polyester, non-sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>96 well plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>cat# 351172</td>
<td>Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene</td>
</tr>
<tr>
<td>Nunclon flask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>cat# 178883</td>
<td>used for large volumes</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates

수명은 몇 가지 유전자 경로에 의해 규제 생물 학적 과정이다. 노화의 생물을 조사하는 한 가지 전략은 동물을 연구하는 것입니다 나이 규제 경로의 구성 요소에 항구 변이. 이러한 변이를 교란 연령 규제 통로의 기능을하기 때문에 전체 유기체의 수명을 변경하는 경우, 그들은 중요한 기계론의 통찰력은 1-3 제공합니다. 수명의 규정을 조사하기 위해 또 다른 전략은 교란 연령 규제 경로에 작은 분자를 사용하는 것입니다. 지금까지 분자의 숫자는 다양한 모델 생물의 수명을 연장하는 것으로 알려져 있으며, 노화 4-16의 생물학을 연구하는 도구로 사용됩니다. 식별 분자의 수는 지금까지 노화의 생물학을 연구에 사용할 수있는 유전자 &quot;도구 모음&quot;에 비해 작습니다. Caenorhabditis 엘레간스 때문에 우수한 유전 3 주동안 짧은 수명의 노화 연구에 사용되는 주요 모델 중 하나입니다. 최근 C.elegans 때문에 작은 크기와 microtiter 플레이트 성장하는 기능 표현형 기반 약물 화면 5,7,16-20를위한 모델 생물로 등장했다. 여기 우리는 96 잘 microtiter 접시에 C.elegans 수명을 측정하는 분석을 제시한다. 분석은 개발하고 성공적으로 C.elegans 수명 7 연장 분자 대형 라이브러리를 화면으로 사용되었습니다. 분석의 신뢰성은 여러 시험에서 평가되었다 : 첫째, 서로 다른 온도에서 성장 야생 유형 동물의 수명을 측정하여, 두 번째 변경 lifespans과 돌연변이의 수명을 측정하여, 셋째, 서로 다른 농도에 대한 응답으로 수명의 변화를 측정하여 약은 Mirtazepine니다. Mirtazepine 이전 C.elegans 7 수명을 연장하기 위해 표시되었습니다. 이 테스트의 결과는 분석이 다른 assays에서 이전 결과를 복제 할 수 있으며, 양적는 것을 보여줍니다. microtiter 형식은 자동 액체 처리 시스템이 수명 분석 호환 차종과 자동 플랫폼에 통합이 가능합니다.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates at JoVE.com

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

이 프로토콜에서 우리는 측정하는 방법을 제시<em&gt; Caenorhabditis 엘레간스</em96 잘 microtiter 접시에&gt; 수명.

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em96 웰 플레이트에 Microtiter> 수명

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

36.0K 조회수.  The Scripps Research Institute. 이 프로토콜에서 우리는 측정하는 방법을 제시 Caenorhabditis 엘레간스 수명.

비디오: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em솔리드 미디어> 수명

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

연구

생물학

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

지드 셀의 파생물로 효모 연대기의 수명 Quantifying

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

버딩 효모에 Replicative 수명 측정

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

얼음 총액 : 성장을위한 방법 Arabidopsis높은 처리량 Genotyping을위한 96 - 웰 플레이트에와 토마토 식물

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

사용<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

의 산화 스트레스 저항을 측정<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 96 웰 마이크로 타이 터 플레이트에

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

C. 예쁜꼬마선충에서 RAN 펩타이드 독성 측정

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, sequester or eliminate damaged proteins to maintain a healthy proteome, thus ensuring cellular proteostasis and preventing further protein damage. Because of redundant functions within the proteostasis network, screening for detectable phenotypes using knockdown or mutations in chaperone-encoding genes in the multicellular organism Caenorhabditis elegans results in the detection of minor or no phenotypes in most cases. We have developed a targeted screening strategy to identify chaperones required for a specific function and thus bridge the gap between phenotype and function. Specifically, we monitor novel chaperone interactions using RNAi synthetic interaction screens, knocking-down chaperone expression, one chaperone at a time, in animals carrying a mutation in a chaperone-encoding gene or over-expressing a chaperone of interest. By disrupting two chaperones that individually present no gross phenotype, we can identify chaperones that aggravate or expose a specific phenotype when both perturbed. We demonstrate that this approach can identify specific sets of chaperones that function together to modulate the folding of a protein or protein complexes associated with a given phenotype.

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

To study chaperone-chaperone and chaperone-substrate interactions, we perform synthetic interaction screens in Caenorhabditis elegans using RNA interference in combination with mild mutations or over-expression of chaperones and monitor tissue-specific protein dysfunction at the organismal level.

조직별 샤페론 상호 작용을 위해 검사하기 위해 Caenorhabditis elegans를 사용

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

측정 Caenorhabditis 엘레간스 수명