Post-larval 고기 분석 및 전체 마운트 Immunohistochemistry 멕시코 Tetra Astyanax mexicanus 를 높이

여기서 우리는 멕시코 테트라 아스티아나엑스 멕시칸을 사육하고, 유충을 키우고, 유충 후 물고기에 대한 전체 산 면역 작용화학을 수행하여 강과 동굴 적응물고기의 표현형을 비교하는 방법을 보여줍니다. 우리는 로티퍼의 영양이 풍부한 식단에 동일한 밀도로 물고기를 올립니다. 이 기술은 일관된 성장을 보장하고 비용, 생물 보안 및 수질에 이점을 제공합니다.

먼저 5갤런 탱크 의 바닥에 플라스틱 메쉬를 놓습니다. 그런 다음 탱크를 물고기 준비 물로 채웁니다. 탱크 측면에 온수기를 부착합니다.

1년 이상 된 암컷 1마리와 수컷 아스티아나엑스 멕시코어 물고기 2마리를 탱크에 넣습니다. 온수기의 온도를 섭씨 24도로 설정합니다. 24시간 후, 온도를 섭씨 1도 씩 높입니다.

달걀을 확인하기 위해 매일 탱크 바닥에 손전등을 비춥춥습니다. 번식 탱크에서 계란이 확인되면 성인 물고기와 플라스틱 메쉬를 제거하십시오. 비커를 사용하여 수심을 10cm로 줄입니다.

수정 시간을 추정하려면, 페트리 접시에 여러 개의 계란을 배치하고 자신의 단계를 결정하기 위해 스테레오 현미경으로 그들을 볼 수있는 전송 파이펫을 사용합니다. 불투명한 계란이나 대변을 제거합니다. 그런 다음 탱크를 물고기 준비 물로 채우고 물에 메틸렌 블루 7 방울을 추가하십시오.

그 후, 탱크에 히터와 수족관 버블러를 추가합니다. 히터를 섭씨 24도로 설정하고 공기 스트림 레귤레이터를 조정하여 부드러운 거품 스트림을 생성합니다. 그런 다음 탱크를 덮어 수온을 유지합니다.

소금 20그램을 8리터의 물고기 준비물에 넣고 녹을 때까지 저어줍니다. 그런 다음 각 보육 용기에 준비된 물 1리터를 넣습니다. 다음으로 각 보육 용기에 부화 유충의 20을 이동하는 전송 파이펫을 사용합니다.

모든 애벌레가 제거되었는지 확인하기 위해 더 큰 탱크에서 물을 교반합니다. 생선 음식을 준비하려면 수확 한 회전기 1 리터에 조류 혼합물 3 ml을 추가하십시오. 5일 후 수정은 각 보육용기에 생선 식품 3ml를 넣습니다.

회전자는 중앙 근처에 보이지 않는 한 컨테이너 모서리에 있는 조밀한 그룹으로 표시되어야 합니다. 매일 로티퍼에 대한 용기를 확인하고 농도가 고갈되면 더 많은 음식을 추가합니다. 죽은 애벌레를 제거하십시오.

먼저, 음식 내용물의 위장관을 지우려면 나일론 메쉬 스트레이너를 통해 원하는 시대의 물고기와 함께 보육용기를 붓습니다. 스트레이너를 깨끗한 물고기가 준비된 물로 용기에 넣고 24시간 동안 음식을 보류합니다. 기관 지침에 따라 물고기를 안락사 한 후, 원추형 튜브에 물고기를 전송하는 전송 파이펫을 사용합니다.

안락사 솔루션을 고정으로 대체합니다. 그리고 4섭씨에서 하룻밤 동안 흔들면서 튜브를 배양합니다. 그런 다음 고정을 제거하고 PBST로 대체합니다.

튜브를 15분 동안 더 흔들어 보배하세요. 그리고 세척 과정을 한 번 더 반복합니다. 다음으로, 전송 파이펫을 사용하여 물고기를 나사 상단 캡이 있는 4ml 유리 바이알로 이동합니다.

유리병에서 PBST를 제거하고 블로킹 용액 3ml를 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 바이알을 배양하여 흔들면 됩니다. 그 후, 전달 파이펫을 사용하여 차단 용액을 제거하고 차단 용액에서 희석된 1차 항체로 대체한다.

동요와 실온에서 하룻밤 유리병을 배양. 다음으로, 이전에 설명한 대로 PBST로 생선을 세 번 씻는다. PBST를 차단 용액에서 희석된 이차 항체로 대체하십시오.

그리고 동요와 실온에서 하룻밤 유리병을 배양. 마지막으로 PBST로 생선을 15분 동안 세 번 씻으시다. 이 프로토콜을 사용하여 표면 물고기 티나자, 몰리노 및 파숑 동굴 물고기는 정적 번식 탱크에서 사육되었습니다.

표면과 파촌은 수정된 배아로 생성되어 항상 부화된 애벌레를 생산합니다. 몰리노와 티나는 실패했지만, 그 때에는 실패했다. 일반적으로 표면 물고기는 산란당 가장 많은 유충을 생산했으며 파촌, 티나야, 몰리노가 각각 그 뒤를 이었다.

전체 마운트 면역 염색 기술은 성공적으로 12.5 일 후에 수정후에 단계에서 뉴런과 췌장 세포를 표지하는 데 사용되었습니다. 유충을 올리고 살아남은 물고기의 수를 기록할 때 죽은 물고기를 제거하는 것이 중요합니다. 많은 물고기가 죽으면 세균또는 곰팡이 오염 때문일 수 있습니다.

탱크는 사용하기 전에 70 %의 에탄올로 살균해야합니다. 우리가 설명한 면역염색 기술은 재료 테이블에 열거된 항체를 위해 성공적으로 사용되었습니다. 면역 염색 후, 물고기는 관심있는 조직을 보기 위해 전체 장착 또는 단면 될 수 있습니다.

조합하여, 사육, 부화 및 면역 염색 절차는 실험실 사이에서 비교되는 방식으로 유전자 활동 NC2를 평가하기 위한 강력한 방법을 제공합니다.