리케차 유전자의 기능적 연구는 병인에서의 역할을 이해하는 데 중요하므로 통제 된 방식으로 유전자를 변경하는 신뢰할 수있는 방법이 필요합니다. 우리의 프로토콜은 전기 천공을 사용하여 Rickettsia 속의 절대 세포 내 박테리아에 외인성 DNA를 도입하여 도입 된 DNA의 효과를 연구 할 수 있습니다. 오늘 저와 함께 절차를 시연하는 것은 Munderloh 박사와 Kurtti 박사의 실험실의 연구원 인 Lisa Price입니다.
시작하려면, 본문에 기재된 바와 같이 90 내지 100%리케차 파케리-감염된 ISE6 세포 배양물을 준비한다. 이어서, Giemsa 염색에 의한 감염 속도를 결정하기 위해, 세포 현탁액을 완전 배지와 1:5의 비율로 희석하고, 100 마이크로리터의 세포 현탁액을 113 G에서 5분 동안 원심분리하여 유리 현미경 슬라이드 상에 침착시킨다. 슬라이드를 자연 건조시킨 후, 이를 무수 메탄올로 실온에서 5분 동안 고정시킨다.
이어서, 슬라이드를 배양하고 섭씨 37도에서 30분 동안 김사 염색한다. 그런 다음 슬라이드를 물로 헹구고 건조되면 오일 대물 렌즈가있는 광학 현미경으로 봅니다. 감염된 세포와 감염되지 않은 세포를 세어 감염된 세포의 백분율을 결정합니다.
무세포 리케차 파케리를 제조하기 위해, 약 0.2 밀리리터의 멸균 60 내지 90 실리콘 카바이드 그릿을 2개의 2밀리리터 멸균 마이크로원심분리 튜브에 붓고 튜브를 따로 보관한다. 5 밀리리터의 배지가 들어있는 이전에 접종 된 Rickettsia parkeri 감염 플라스크에서 세포층을 방해하지 않도록주의하면서 2 밀리리터의 배지를 제거합니다. 그런 다음 나머지 3 밀리리터의 배지로 세포를 재현탁하십시오.
이 현탁액을 준비된 두 개의 실리콘 카바이드 그릿 튜브 사이에 균등하게 나누고 튜브를 30초 동안 고속으로 와동시킵니다. 그런 다음 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 플런저를 연장하여 멸균 된 5 밀리리터 루어 잠금 주사기를 준비하고 플런저 끝을 15 밀리리터 원추형 튜브를 고정하는 데 사용되는 폴리스티렌베이스에 삽입합니다.
고무 전구로 작동하는 장벽 2 밀리리터 파스퇴르 피펫을 사용하여 모래를 흡인하지 않고 와류 세포의 상층액을 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 피펫 팁을 주사기 허브 입구에 삽입하고 내용물을 부드러운 압력으로 주사기에 배출합니다. 다음으로, 리케차 파케리 배양물을 주사기 허브에 장착된 멸균 2마이크로미터 공극 크기 필터를 통해 멸균 1.5밀리리터 튜브에 여과하고 섭씨 4도에서 5분 동안 튜브를 13, 600G으로 원심분리합니다.
상청액을 제거한 후, 세포 펠릿을 1.2 밀리리터의 300 밀리몰 얼음-차가운 자당 용액으로 2 회 세척한다. 샘플을 원심분리하고 세척 사이에 상청액을 제거합니다. 원심분리가 끝나면 풀링된 세포 펠릿을 각각 2 내지 3개의 형질전환 샘플에 대해 100 내지 150 마이크로리터의 빙냉 자당 용액으로 재현탁시킨다.
그런 다음 샘플을 사전 냉각된 멸균 1.5마이크로리터 마이크로원심분리 튜브에서 50마이크로리터 분취량으로 나눕니다. 3마이크로그램의 내독소가 없는 pRAM18sSFA 플라스미드 DNA를 얼음 위의 리케차 파케리 50마이크로리터가 들어 있는 각 튜브에 형질전환하고 피펫 팁으로 부드럽게 저어줍니다. 혼합물을 0.1cm 간격 크기의 사전 냉각 멸균 전기 천공 큐벳으로 옮깁니다.
큐벳을 부드럽게 두드려 혼합물을 고르게 분배하고 얼음 위에서 10-30분 동안 배양합니다. 한편, 완전히 합류한 이전에 배양된 ISE6 세포 배양 플라스크에서 배지를 제거하고 중탄산나트륨 및 HEPES 완충액을 포함하는 1.5밀리리터의 신선한 배지로 세포를 부드럽게 헹구어 세포층을 재현탁시킵니다. 균질한 세포 현탁액을 생성한 후, 전체 부피를 단일 멸균 2밀리리터 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다.
다음으로, 리케차 파케리 및 플라스미드 DNA 혼합물을 전기천공기를 사용하여 전기천공한다. 전기천공 후 멸균 확장 파인팁 피펫을 사용하여 소량의 ISE6 세포 현탁액을 큐벳으로 옮기고 위아래로 부드럽게 피펫하여 전기천공된 리케차 파케리를 회수합니다. 그런 다음 큐벳의 내용물을 ISE6 세포 현탁액의 나머지 부분을 포함하는 2밀리리터 튜브로 옮깁니다.
다음으로, 샘플을 실온에서 원심분리하고, 먼저 700G에서 2분 동안 ISE6 세포를 풀다운한 다음, 13, 600G에서 1분 동안 리케차를, 리케차를, 풀다운한다. 튜브를 섭씨 34도에서 15 분에서 1 시간 동안 배양하십시오. 배양 후, 하나의 형질전환의 재현탁된 내용물을 중탄산나트륨 및 HEPES 완충액이 있는 3.5ml의 신선한 배지를 포함하는 하나의 25제곱센티미터 세포 배양 플라스크로 옮깁니다.
플라스크를 흔들어 혼합물을 고르게 펴고 섭씨 34도에서 배양합니다. 16 내지 24시간 후, 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신을 각각 10 마이크로리터씩 인큐베이션된 플라스크에 첨가한다. 플라스크를 흔들어 항생제를 배지에 고르게 혼합한 후 플라스크를 인큐베이터로 되돌립니다.
야생형 리케차 파케리 및 ISE6 세포의 성공적인 증식은 Giemsa 염색에 의해 명백하였다. 세포 내 및 세포 외 리케치에서 Giemsa와 함께 짙은 보라색으로 염색 된 ISE6 세포의 핵이 보입니다. ISE6 세포에서 적색 형광 단백질을 발현하는 리케차 파케리의 형질전환은 배양 7일 후 공초점 현미경으로 확인하였다.
감염률의 실질적인 증가는 10 일 후에 관찰되었다. 전체 절차 중에 모든 것을 멸균 상태로 유지하십시오. 리케차의 일부 종은 변형하는 데 오랜 시간이 걸리며, 특히 느리게 성장하는 내 공생체는 세부 사항에주의를 기울이고 인내심을 가지십시오.
이 프로토콜은 리케차 생물학의 여러 측면과 절지 동물 벡터 및 포유류 숙주와의 상호 작용에 대한 연구를 가능하게했습니다. 예를 들어, 형광 단백질 발현 리케시는 운동성 및 공생 진드기 세포 상호작용을 추적하기 위해 사용되어 왔다.
