이 연구는 전임상 환경에서 맹장암 치료제 및 병리학 연구에 대한 새로운 접근 방식을 보여줍니다. 이러한 방법은 다른 악성 종양 연구에 더 광범위하게 적용될 수 있습니다. 맹장암은 질병 모델링을 위한 마우스에서 맹장이 없는 경우 발병률이 낮기 때문에 연구하기 어렵습니다.
이 기술을 사용하면 종양 미세 환경 내에서 세포 상호 작용을 연구 할 수 있습니다. 이 방법은 결장직장암 및 난소암과 같이 망막으로 전이되는 경향이 있는 여러 유형의 암의 생물학을 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 운송 및 배양 배지를 준비하는 것으로 시작하십시오.
조직이 도착하면 가성 점액종 복막 종양 조직을 직경 6cm의 접시를 포함하는 35개의 완전한 DMEM으로 옮깁니다. 액화된 점액 또는 점액이 많은 조직 영역을 제거하는 것 외에도 메스로 자르기 어려운 조직을 제거합니다. 종양 조직 결절을 대략 1 입방체 센티미터의 작은 조각으로 자릅니다.
아가로스 제제 및 조직 포매를 위해, 조직이 도착하는 경우 같은 날 태아 소 혈청 또는 FBS가 없는 PBS에 저융점 아가로스의 5% 용액을 준비합니다. 표본을 덮을 때까지 2-3개의 작은 종양 표본이 들어 있는 6cm 접시에 액체 5% 아가로스 용액을 추가합니다. 내장된 티슈를 섭씨 4도의 냉장고에 30분 동안 넣습니다.
비브라톰에서 조직 표본을 분리하고, 냉장고에서 응고된 오거를 제거하고, 메스를 사용하여 조직 너비보다 약간 큰 아가로스 큐브를 자릅니다. 비브라톰 단계에 슈퍼 접착제를 바르고 아가로스 큐브를 슈퍼 접착제에 1-2분 동안 부드럽게 올려 고정합니다. 블레이드를 비브라톰에 고정하고 최적의 다운스트림 이미징을 위해 조직 섹션의 두께를 약 150-250미크론으로 설정합니다.
조직 절편을 배양하기 위해, 투과성 멤브레인 위에 2밀리리터의 완전한 DMEM 배지를 첨가하고 투과성 멤브레인 아래에 3밀리리터를 첨가하여 투과성 삽입판을 준비한다. 다음으로, 얇은 페인트 브러시를 사용하여 비브라톰의 절단 챔버에서 조직 조각을 부드럽게 들어 올리고 완전한 DMEM이 들어 있는 투과성 배양 접시에 2-4개의 조각을 넣습니다. 섭씨 37도에서 최대 7일 동안 5% 이산화탄소로 슬라이스를 배양합니다.
배지를 교체하는 동안 24시간마다 세포 사멸을 위한 대조군으로 보르테조밉을 추가하고 테스트 가능한 화학 요법 5-플루오로우라실 또는 5-FU를 배양 배지에 추가하여 약리학적 개입을 수행합니다. 컨포칼 이미징 분석을 위해 종양 절편을 1%FBS가 포함된 PBS가 포함된 12웰 접시의 단일 웰에 놓습니다. 칼슘 이미징 실험의 경우 PBS 대신 세포를 추가 칼슘 용액에서 슬라이스를 배양합니다.
조직 절편의 생존력을 결정하기 위해 이미징 염료로 샘플을 염색합니다. 생존성 염료를 첨가한 후 10분 내지 1시간 동안 배양한다. 배양 후 슬라이스를 1%FBS가 포함된 PBS가 들어 있는 광학적으로 투명한 유리 바닥 페트리 접시에 옮겨 공초점 이미징 장치에서 이미징에 사용합니다.
1밀리리터 피펫 팁의 끝에서 작은 조각을 잘라 개구부를 넓히고 피펫팅에 의한 강력한 기계적 해리를 허용합니다. 섭씨 37도에서 1 밀리리터의 소화 완충액에서 5-15 분 동안 회전하면서 슬라이스를 배양하고, 기계적 해리를 사용하여 배양하는 동안 2-3 회 격렬한 조직 파괴를 가합니다. 조직이 소화되면 50밀리리터 원뿔형 튜브 위에 놓인 70마이크로미터 필터에 분해 매체로 파기된 조직을 옮깁니다.
멸균 집게 또는 피펫을 사용하여 더 큰 조각을 선택하십시오. 플라스틱 5밀리리터 주사기의 뭉툭한 백엔드를 사용하여 해리되지 않은 더 큰 조각을 으깨고 2%FBS가 포함된 PBS 4밀리리터로 세척합니다. 해리된 세포 상층액과 원심분리기를 300G에서 5-10분 동안 취한다.
상청액을 제거하고 2%FBS를 함유한 PBS 1밀리리터로 펠릿을 세척합니다. 유세포 분석을 위해 샘플을 준비하기 위해, 50 마이크로리터의 인간 FC 블록을 함유하는 블로킹 완충액을 첨가하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다. 2%FBS를 함유한 PBS 50마이크로리터에서 각각의 항체를 사용하여 추가 세포 염색을 수행합니다.
대조군 및 치료 조건을 위한 완전한 배지 5밀리리터를 분취합니다. 투과성 접시 상에 도말된 2 내지 4개의 슬라이스 상에, 대조군 처리 분취액 및 하류 생존력, 생사 분석에 사용될 추가의 조합 요법으로부터의 배지를 첨가한다. 조직 절편을 완전한 DMEM이 포함된 배양물에 2-5일 동안 방치하고 배지와 보르테조밉 및 5-FU를 격일로 교체합니다.
발광 생존도 분석을 위해, 500 마이크로리터의 PBS를 12-웰 디쉬에 첨가하고, 페인트브러시 또는 1밀리리터 피펫을 사용하여 순차적으로 매칭된 조직 절편을 PBS 용액으로 옮긴다. 조각에서 PBS를 제거합니다. 조건당 500 마이크로리터의 발광 생존도 용액을 첨가하고, 발광 플레이트 판독기를 사용하여 발광을 판독하기 전에 실온에서 30분 동안 쉐이커 상에서 천천히 회전하면서 인큐베이션한다.
조직 절편에서의 뮤신 염색은 주기적 산 이동 염색 및 뮤신 특이적 항체를 사용하여 시각화하였다. 칼세인 AM과 프로피듐 요오드화물에서의 배양은 건강과 생존력을 결정했습니다. 핵은 배양 중에 증식된 세포와 겹쳤다.
이들 결과를 정량화하여 종양 절편 내에서 증식하는 세포의 수를 결정하였다. CD11b PE 접합 항체 및 Fluo-4 AM에서 배양된 슬라이스를 CTU에서 국소 면역 세포로 표지하였다. 세포 내 칼슘 수준을 보여주는 유사 색상 스케일 이미지를 통해 세포 내 칼슘의 차등 수준을 시각화 할 수있었습니다.
강조된 CD11b 양성 면역 세포 내에서 세포간 칼슘 반응 전, 도중 및 후에 대한 자발적 활동 추적 및 시간 경과가 여기에 표시됩니다. CD11b 면역 세포에서 칼슘 반응의 원시 흔적과 다른 반응성 및 비반응성 세포를 정량화했습니다. 복막막성 가성점액종을 갖는 환자 종양 샘플의 면역형 분석의 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있다.
종양 면역 프로파일의 정량화는 공여자 표본(337)이 높은 수준의 M2 대식세포를 갖는 것으로 나타났으며, 이는 가성점액종 복막-유래 조직 절편을 이용하는 것이 환자 종양 샘플의 독특한 공여자 세포 풍경의 심문을 허용한다는 것을 나타낸다. 가성 점액종 복막종 인간 조직의 조직 절편의 약물형 분석 및 다운스트림 분석은 세포독성 분석 및 터널 공초점 이미징에 의해 확인된 바와 같이 종양 절편에서 세포의 사멸을 보여주었습니다. 세포 독성 약물, 보르 테조 밉 및 5- 플루오로 우라실에 대한 반응.
발광 생존율 분석은 순차적으로 매칭된 슬라이스를 사용하여 수행하였다. 점액성 종양에서 절편을 성공적으로 생산하려면 지방 및 조밀한 복벽 조직과 같은 세포 및 무세포 조직 구성 요소를 세심하게 해부하고 제거해야 합니다. 이 기술은 지방, 혈관 및 면역 세포 상호 작용과 같은 종양 미세 환경에서 암세포와 여러 세포 유형 간의 상호 작용을 모델링할 수 있습니다.
