X 염색체 이상이 있는 여성의 난소 세포에 대한 FISH 분석은 이 특정 그룹에서 난소 세포의 X 염색체 함량에 대한 통찰력을 얻을 수 있는 독특한 기술입니다. 이러한 기술은 X 염색체 이상을 가진 여성의 생식 가능성에 대해 더 많이 배우는 데 도움이 될 수 있습니다. 두 방법 모두 향후 연구를 용이하게 하기 위한 것이며 임상 실습에서 진단 도구로 사용하도록 설계되지 않았다는 점을 언급하는 것이 중요합니다.
이 절차를 시연하는 것은 불임 실험실의 선임 연구원 인 Ronald Peek과 병리학 부서의 분석가 인 Milad Intezar가 될 것입니다. 시작하려면 메스를 사용하여 냉동 보존되거나 해동 된 난소 피질 조직을 하나씩 하나씩 작은 조각으로 자릅니다. 섭씨 37도에서 75 분 동안 예열 된 L15 4 리터의 조직 단편을 효소 적으로 소화시킵니다.
15분마다 소화 혼합물을 위아래로 피펫팅합니다. 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 차가운 L15 4밀리리터를 추가하여 효소 소화를 중지합니다. 해리된 조직을 500g에서 원심분리하여 8밀리리터의 차가운 L15 배지로 한 번 세척한 후 500마이크로리터의 L15 배지에 재현탁합니다.
주로 개별적인 기질 세포와 작은 모낭을 포함하는 세포 현탁액을 플라스틱 페트리 접시에 옮기고 실체 현미경으로 현탁액을 검사합니다. 75마이크로미터 플라스틱 피펫을 사용하여 크기가 50마이크로미터 미만인 모낭을 수동으로 선택하고 섭씨 4도에서 10% FBS가 보충된 L15 배지 방울로 옮깁니다. 그런 다음 정제된 모낭을 0.06% 트립신, 밀리리터 EDTA당 1밀리그램, 포도당 밀리그램 1밀리그램의 용액으로 옮기고 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다.
인큐베이션 후, 75 마이크로미터 플라스틱 피펫을 사용하여 피질 세포 현탁액으로부터 난소 기질 세포를 수득한다. 형광 In Situ 하이브리드화 또는 개별 난소 세포의 FISH 분석을 위해 트립신/EDTA/포도당으로 처리된 난소 난포 또는 기질 세포를 슬라이드에서 0.15밀리몰 염화칼륨 5마이크로리터와 DPBS 15마이크로리터의 방울로 옮기고 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다. 슬라이드를 300 마이크로 리터의 0.05 밀리몰 염화칼륨, 7.5 % 아세트산 및 22.5 % 메탄올에서 2 분 동안 건조시키고 미리 고정시킵니다.
슬라이드를 3:1 메탄올 아세트산으로 2분 동안 덮어 고정을 완료합니다. 고정 후 섭씨 73도에서 갓 준비한 SSC에서 샘플을 두 번 세척합니다. 100마이크로리터의 2% 프로테이나제 K로 덮고 커버 슬립으로 밀봉합니다.
하이브리드화 스테이션에서 섭씨 37도에서 10분 동안 슬라이드를 인큐베이션합니다. 인큐베이션 후, 커버 슬립을 제거하고, 진탕 하에 실온에서 DPBS에서 5분 동안 슬라이드를 세척한다. 1% 포름알데히드로 5분 동안 샘플을 고정합니다.
그런 다음 슬라이드를 DPBS로 세척하고 각각 2분 동안 증가하는 에탄올 농도로 연속적으로 탈수합니다. 샘플을 형광 표지된 프로브와 혼성화하기 전에 자연 건조합니다. 다음으로, 1 마이크로리터의 CEPX, 1 마이크로리터의 CEP18 및 18 마이크로리터의 하이브리드화 완충액을 샘플에 첨가하고 슬라이드에 접착된 커버 슬립으로 밀봉한다.
슬라이드를 섭씨 73도에서 3분 동안 변성시키기 위해 하이브리드화 스테이션으로 옮긴 다음, 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 하이브리드화합니다. 하이브리드화 후 슬라이드에서 커버 슬립과 남아 있는 접착제를 제거합니다. 슬라이드를 섭씨 72도에서 0.4X SSC, 0.3% Tween-20에서 2분 동안 세척한 다음, 2X SSC 및 0.1% Tween-20에서 1분 동안 배양합니다.
그림과 같이 슬라이드를 탈수하고 DAPI가 포함된 장착 매체로 덮기 전에 어두운 곳에서 자연 건조합니다. 형광 현미경으로 분석하기 전에 슬라이드를 섭씨 영하 20도에서 10분 동안 놓습니다. 파라핀 절편을 혼성화하려면 파라핀 리본에서 모낭이 포함된 절편 앞이나 뒤에 새 절편을 선택합니다.
유리 슬라이드에 한 섹션을 장착하고 섭씨 56 도의 스토브에서 45 분 동안 건조시킵니다. 섹션을 크실렌에서 10분 동안 탈파라핀화한 다음 슬라이드를 99.5% 에탄올에 담그고 수돗물에 5분 동안 헹굽니다. 슬라이드를 섭씨 96도에서 10분 동안 표적 회수 용액으로 전처리합니다.
식힌 후 슬라이드를 증류수로 헹굽니다. 슬라이드를 0.01몰 염산으로 5분 동안 처리한 다음 섭씨 37도에서 15분 동안 펩신 소화를 합니다. 슬라이드를 염산으로 다시 헹구고 PBS로 헹굽니다.
슬라이드를 1% 포름알데히드 PBS에 5분 동안 고정합니다. 그런 다음 슬라이드를 PBS로 간단히 헹구고 탈염수로 다시 헹구고 99.5% 에탄올로 탈수합니다. 전처리된 슬라이드에 5마이크로리터의 프로브 CEP18 및 CEPX를 적용합니다.
그런 다음 커버 슬립을 바르고 포토 접착제로 해당 부위를 밀봉하십시오. 섭씨 80도에서 10분 동안 변성하고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 혼성화를 위해 하이브리드화에 슬라이드를 놓습니다. 다음날, 슬라이드를 섭씨 42도의 SSC에서 각각 5분씩 두 번 헹구고, 섭씨 73도의 0.3% Nonidet P-40에서 2분 및 1분간 헹굽니다.
다시 슬라이드를 2X SSC로 헹구고 증류수로 헹구고 99.5% 에탄올로 탈수합니다. 슬라이드를 자연 건조하고 DAPI 함유 장착 매체에 장착합니다. 환자 A의 냉동 보존된 난소 피질 조직은 림프구의 50%, 45, X 핵형, 50%가 46, 환자 B의 림프구의 38%XX.In 45, X, 28%는 46, XX, 34%는 47, XXX였다.
주변 기질 세포도 X 염색체 함량에 대해 분석되었습니다. 난소 피질 조직의 효소 소화는 크게 해리된 세포의 현탁액을 초래했지만, 과립증 세포의 단일 층으로 둘러싸인 온전한 난모세포로 구성된 원시 난포를 남겼습니다. 작은 모낭은 육아화 세포의 응집으로 인해 FISH 후 신호를 해석하는 데 어려움을 겪었습니다.
FISH 전에 트립신으로 모낭을 추가로 소화하면 개별 육아 세포가 모낭 표면의 구형 형태로 수축했습니다. 헤마톡실린 에오신 염색은 이종이식 5개월 후 난소 피질 조직에서 형태학적으로 정상적인 이차 및 전방 난포를 보여주었습니다. 이들 모낭의 육아증 세포의 X 염색체 함량은 FISH 분석에 의해 결정되었습니다.
이식된 난소 피질 조직을 Bouin 용액에 고정하면 녹색 연무로 인해 여포 세포에서 형광 신호가 흐려지고 크게 가려졌습니다. 대조적으로, 포름알데히드로 고정된 난소 피질 조직은 우수한 형광 신호를 제공했습니다. 이 프로토콜의 주요 과제는 난소 세포의 분리와 조직의 효소 소화에 있습니다.
이 프로토콜에서 벗어나면 과정 중에 난소 세포가 크게 손실될 수 있으며, 특히 이미 난소 예비력이 낮은 여성에서는 피해야 합니다. 추가 유전자 발현 프로파일링은 이수성 난소 세포가 모낭 형성에 미치는 영향과 X 염색체 이상이 있는 여성의 조기 난소 부전 과정에 대해 자세히 알아보는 데 도움이 될 수 있습니다.
