우리는 고정된 세포의 형광 현미경 이미지에서 미토콘드리아를 분석하기 위해 시뮬레이션 지도 기계 학습 도구를 사용하는 방법을 보여줍니다. 현미경 이미지에서 미토콘드리아를 분할하는 현재 방법에는 Ostu 또는 수동 분할과 같은 자동 임계값 기반 방법이 포함됩니다. 임계값 기반 기술은 신호 대 배경 비율이 낮은 경우 성능이 저하됩니다.
일반적으로 형태학적 분석을 위한 이미지에는 많은 수의 미토콘드리아가 포함되어 있어 수동 분할이 지루합니다. 지도 딥러닝 방법은 높은 정확도로 분할을 수행하지만 훈련을 위해 많은 수의 입력 실측 쌍 데이터가 필요합니다. 이 접근 방식은 물리학 기반 시뮬레이터를 사용하여 현미경 이미지 쌍과 2D 실측 형상 마스크를 생성하므로 수동 주석이 필요하지 않습니다.
시뮬레이션된 이미지에서 훈련된 모델은 실제 현미경 이미지에서 미토콘드리아를 분할하는 데 사용됩니다. 우리는 이 작업을 높은 정확도로 자동화할 수 있고 훈련을 위해 주석이 달린 실측 데이터 세트가 필요하지 않은 딥러닝 기반 세분화 도구를 사용합니다. 시뮬레이션은 형상 생성을 위해 파라메트릭 곡선을 사용하는 형상 생성으로 시작됩니다.
이미 터는 균일하게 분포되고 밀도가 실험 값과 일치하도록 생성 된 모양의 표면에 무작위로 배치됩니다. 현미경의 3D PSF는 깁슨-라니 모델을 사용하여 계산됩니다. 시뮬레이션된 이미지와 실험 이미지 사이의 포토리얼리즘을 달성하기 위해 우리는 어두운 노이즈와 샷 노이즈를 모두 에뮬레이트합니다.
물리학 실측 자료는 이진 맵의 형태로 생성됩니다. 우리는 컨포칼 현미경을 사용하여 이미징된 고정 심근모세포의 미토콘드리아 형태에 대한 CCCP 치료의 효과를 평가합니다. 세포 배양.
세포를 시딩하기 위해, 멸균 층류 후드에서 작동하고, 각 실험 조건에 대한 커버 슬립을 12 웰 플레이트의 웰에 배치함으로써 준비한다. 각 웰에 적절한 양을 분주하기 전에 원심분리 튜브의 내용물을 위아래로 여러 번 피펫팅하여 희석된 세포 현탁액이 적절하게 혼합되었는지 확인합니다. 실험 절차.
12웰 플레이트의 웰에서 세포 배양 배지를 흡인한 다음 새로운 예열 배지를 제어 웰에 빠르게 적용하고 10마이크로몰 CCCP 용액으로 예열된 배지를 테스트 조건 웰에 적용합니다. 섭씨 37도 세포 배양기에서 2 시간 동안 배양하십시오. 웰에서 세포 배양 배지를 흡입하고 예열 된 고정 용액을 적용하십시오.
커버 슬립에 세포의 염색 및 장착. 준비된 유리 슬라이드에 10마이크로리터 장착 미디어를 추가하여 커버 슬립을 장착합니다. 핀셋을 사용하여 12웰 플레이트에서 커버 슬립을 집어 들고 준비된 보풀이 없는 종이 타월에 커버 슬립의 가장자리와 뒷면을 짧게 터치하여 커버 슬립에서 수분을 제거합니다.
장착 미디어의 대기 중인 물방울 위에서 덮개 슬립을 부드럽게 내립니다. 현미경 및 이미징. 접안렌즈를 사용하여 Z 레벨을 수동으로 조정하여 샘플에 초점을 맞춥니다.
소프트웨어 내에서 획득한 탭으로 전환합니다. 스마트 설정을 사용하여 이미징에 사용할 형광 채널을 선택합니다. 커버 슬립 중앙에 배열 중앙에 있으며 총 12개의 위치가 이미지화됩니다.
RA를 커버 슬립의 중심을 중심으로 배치합니다. 자동화된 방식으로 여러 위치를 이미지화할 수 있습니다. 시뮬레이션된 학습 데이터 생성.
코드를 다운로드하고 내용의 압축을 풉니다. 지침 및 읽어보기에 따라 환경을 설정합니다. src"사본을 만들거나 폴더 사용 2.
미토콘드리아 시뮬레이션 Airy"라고 이름을 바꿉니다. 이 폴더에는 학습 데이터의 시뮬레이션과 관련된 모든 파일이 들어 있습니다. 시뮬레이션을 위해 설정할 세 가지 매개변수 세트가 있습니다.
먼저 배치 구성 파일에서 시뮬레이터에 대한 미토콘드리아 수, 직경 범위, Z 축 범위 및 형광단 밀도의 매개 변수를 설정합니다. 다음으로 파일 현미경PSF 모드에서 데이터 세트의 개구수, 배율 및 최소 파장의 광학 매개 변수를 설정합니다. py"화재 generate_batch_parallel에서 픽셀 크기와 방출 파장에 대해 원하는 값을 설정합니다.
py"출력 이미지의 크기, 각 이미지의 타일 수 및 파일 generate_batch_parallel의 총 이미지 수와 같은 출력 데이터 세트와 관련된 세 번째 매개 변수 집합을 설정합니다. py"파일을 generate_batch_parallel 실행하십시오. py"를 클릭하여 시뮬레이션을 시작합니다.
최종 크기의 이미지를 얻으려면 5라는 폴더의 복사본을 만듭니다. 데이터 준비 및 교육 / 데이터 준비"로 이동합니다. 배치 번호의 매개 변수와 배치 당 이미지 수, 파일 Data_generator에 추가 할 노이즈 범위를 설정합니다.
py"파일을 Data_generator 실행하십시오. py"몽타주 이미지를 만듭니다. image"및 segment"라는 폴더를 데이터 트레인/기차" 폴더에 복사합니다.
딥 러닝 기반 세분화. 새 현미경 이미지 설정을 위한 분할 모델을 훈련하려면 train"이라는 폴더로 이동하여 train_unet라는 파일 내에서 바흐 크기, 분할을 위한 백본 모델, Epoch 수 및 훈련을 위한 학습률의 매개변수를 설정합니다. py"파일을 train_unet 실행하십시오.
py"교육을 시작합니다. 학습 프로세스에는 시뮬레이션된 검증 집합에서 세분화 모델을 평가하기 위한 메트릭이 표시됩니다. 학습이 완료되면 모델이 best_model로 저장됩니다.
h5"라는 폴더에 train"현미경 이미지에서 모델을 테스트하려면 이미지를 기차 모델에서 원하는 크기로 분할해야 합니다. 이를 위해 6이라는 폴더로 이동합니다. 테스트 데이터 준비"를 선택하고 데이터의 PNG 형식 파일을 PNG 폴더에 복사하고 파일을 split_1024_256 실행합니다.
py"이렇게 하면 데이터 폴더에 이미지의 256 x 256 크기 자르기가 생성됩니다. 이미지 자르기를 분할하려면 7이라는 폴더로 이동합니다. 세그멘테이션 테스트"를 클릭하고 segment라는 파일을 실행합니다.
py"사용할 저장된 모델의 이름을 설정 한 후. 분할된 이미지는 출력 폴더에 저장됩니다. 형태 학적 분석.
이름이 make_montage인 파일을 배치합니다. py"라는 폴더에 7. 분할 테스트"를 실행하고 파일을 실행하여 분할된 출력을 이미지의 원래 크기로 다시 연결합니다.
9라는 새 폴더를 만듭니다. 형태소 분석"을 클릭하고 해당 폴더로 이동합니다. 명령을 사용하여 skan 및 seaborn 라이브러리 설치 pip seaborn skan"분할 마스크는 skan이라는 라이브러리를 사용하여 골격화됩니다"개별 미토콘드리아의 토폴로지를 분석 할 수 있습니다.
파일을 폴더 9에 넣습니다. 형태소 학적 분석"실험의 다른 그룹의 이미지를 폴더 안의 다른 폴더로 배열 7. 테스트 분할"파일을 실행하여 분석을위한 플롯을 만듭니다. 결과.
수행 할 정량 분석은 연구 질문 또는 가설에 따라 다릅니다. 우리의 실험에서 우리는 미토콘드리아의 세 가지 형태, 즉 점"작은 미토콘드리아 비트, 막대"미토콘드리아와 같은 섬유 모양 또는 끈, 다중 분기 네트워크"형태를 식별하기 위해 먼저 분할 출력을 골격화하고 다른 클래스의 분기 링크를 분석합니다. 갈락토오스 적응 세포의 두 그룹, 대조군 및 CCCP 처리군에 대한 분석 결과를 보여줍니다.
우리는 CCCP에 노출되었을 때 미토콘드리아가 팽창하는 것을 감안할 때 예상되는 점의 평균 가지 길이가 크게 증가하는 것을 볼 수 있습니다. 간상체와 네트워크 클래스의 개별 길이에서 미토콘드리아의 비율은 세포가 CCCP로 처리되었을 때 대조군에 비해 현저히 감소하여 우리의 가설을 입증합니다. 우리 방법의 어려운 시나리오는 이미지가 미토콘드리아를 조밀하게 포장하는 경우입니다.
분홍색은 이미지에서 검출 된 가장 긴 단일 미토콘드리아를 나타내며, 이는 분할 결과의 오류 증가로 인해 발생합니다. 이러한 실패 사례는 미토콘드리아의 길이를 제어하고 형태 학적 연산자를 사용하여 감지 할 수 있습니다. 우리의 응용 프로그램은 미토콘드리아 형태 분석을 수행 한 방법의 예이지만, 우리는 그러한 분석 및 연구 질문이 미토파지 및 관련 생물학적 실험의 다양한 측면에 대해 공식화 될 수 있다고 믿습니다.
