우리는 이 방법을 성공적으로 사용하여 담도 폐쇄증의 병리학적 변화와 더 일치하는 마우스 모델을 만들었습니다. 이 기술은 급성 및 만성 담도 폐쇄증의 증상을 시뮬레이션할 수 있어 향후 질병 메커니즘 연구에 도움이 됩니다. 항체 사용 후 마우스의 생존 기간이 연장되고 증상이 완화되어 담도 폐쇄증에 대한 항체의 치료 효과를 시사합니다.
원고에 설명 된대로 신생아 마우스를 여러 그룹으로 나눈 후, 붉은 털 로타 바이러스 또는 RRV 주사 4 시간 전에 5 마이크로 그램의 항 -Ly6G 항체를 복강 내 주사하여 각 마우스를 전처리하여 Gr1 양성 세포를 고갈시킵니다. 출생 후 24 시간 이내에 신생아 마우스에 20 마이크로 리터의 붉은털 로타 바이러스 또는 식염수를 복강 내 주사합니다. RRV 주사 후 20마이크로그램의 항-Ly6G 항체를 마우스의 복부에 투여합니다.
매일 모든 생쥐의 외모, 체중 및 생존을 확인하고 기록하십시오. 복강 주사의 경우 한 손의 검지와 엄지 손가락으로 목 피부를 꼬집고 약지와 꼬리 손가락으로 마우스의 뒷다리를 부드럽게 잡아 어린 마우스의 복부를 노출시킵니다. 주사기 바늘을 위쪽으로 기울여 들어 올리고 마우스의 오른쪽 뒷다리 허벅지 중간에 피부와 15도 각도로 바늘을 삽입합니다.
바늘이 마우스의 오른쪽 늑골 가장자리에 도달 할 때까지 피하 경로를 따라 바늘을 움직이면서 바늘을 복강 내로 향하게하고 마우스의 간 아래에 액체를 주입합니다. 주사 직후 바늘을 빼냅니다. 주사 부위의 출혈이나 누출을 관찰하십시오.
12일째에 마우스를 마취한 후 현미경으로 해부한다. 1 밀리리터 인슐린 주사기를 심장의 좌심실에 삽입하여 혈액을 채취하십시오. 혈액을 400g에서 실온에서 5분간 원심분리하고, 간 기능 측정을 위해 혈청을 분리한다.
가위와 핀셋을 사용하여 주변 조직에서 마우스 간과 비장을 해부합니다. 간과 담관의 일반적인 모습을 촬영하십시오. 흡입 마취 후 간, 담낭 및 간외 담관을 가위와 면봉으로 노출시킵니다.
자세 현미경에서 1 밀리리터 인슐린 주사기로 5-10 마이크로 리터의 형광 염료 로다 민 123을 담낭에 주입하고 사진을 찍습니다. 신선한 마우스 간 조직을 10 % 포르말린에 24 시간 동안 담그십시오. 조직이 파라핀에 묻히면 파라핀 마이크로톰을 사용하여 파라핀 블록을 4마이크로미터 두께의 섹션으로 자르고 동일한 슬라이드에 두 개의 연속 섹션을 배치합니다.
그런 다음 슬라이스를 슬라이싱 랙에 넣고 크실렌으로 왁스를 제거한 다음 무수 에탄올, 95% 에탄올, 80% 에탄올, 70% 에탄올 및 증류수에서 각각 5분 동안 연속적으로 수화합니다. 헤마톡실린 용액으로 절편을 5분 동안 염색하고 1% 염산과 75% 알코올에 5초 동안 담근다. 깨끗한 물로 섹션을 헹구고 1 분 동안 에오신 용액으로 얼룩지게하십시오.
앞에서 설명한 대로 염색을 위해 조직 절편을 준비하고 Tris-EDTA 완충액으로 항원 복구를 수행합니다. 전자레인지에 섭씨 95도의 10분간 가열한 후 꺼내 실온으로 자연 식힌다. 내인성 과산화효소를 제거하려면 조직 절편을 3% 과산화수소에 10분 동안 넣고 슬라이스를 5% 염소 혈청으로 처리하여 비특이적 결합을 차단합니다.
다음으로, 1차 쥐 항-마우스 사이토케라틴 19 또는 쥐 항-마우스 F4/80 단클론 항체를 절편에 추가하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 적절한 2차 항체가 있는 절편을 실온에서 30분 동안 배양합니다. 3,3-프라임-디아미노벤지딘을 발색제로 사용하여 현미경으로 발색 반응을 관찰합니다.
40x 현미경으로 슬라이스를 관찰하여 사진을 얻고 필요에 따라 분석합니다. 조직 절편이 준비되고 헤마톡실린으로 대조염색되면 실온에서 1시간 동안 50마이크로리터의 시리우스 레드 염료 용액으로 각 조직을 덮습니다. 슬라이드를 실온에서 4시간 동안 자연 건조시키고 각 슬라이드에 중성 껌 한 방울을 떨어뜨린 다음 커버 슬립을 사용하여 기포를 피하기 위해 조직을 덮습니다.
슬라이드를 실온에 24시간 동안 두어 중성 검을 응고시킵니다. 편광 조영광 현미경을 사용하여 콜라겐 증착 세부 사항을 관찰합니다. 선명하고 적합한 시야를 선택하고 현미경 시야의 밝기와 화이트 밸런스를 조정합니다.
이미지를 획득하고 필요에 따라 40x 현미경으로 분석합니다. RRV 주사 후 RRV 그룹의 평균 생존 기간은 13일이었습니다. 항체로 처리된 대부분의 마우스에서 경미한 황달이 발생했으며 체중 감소는 관찰되지 않았습니다.
BA 마우스의 간은 괴사성 병변과 담관 폐쇄증의 간외 부분을 보여주었습니다. 간의 크기는 대조군보다 작습니다. 조직학적 분석에서 저용량 항-Ly6G 요법이 문맥 염증을 감소시키는 것으로 나타났습니다.
염증 세포 축적은 42일째에 간 조직 절편에서 여전히 관찰되었다. 12일째에는 문맥 영역에서 콜라겐 침착이 약간 증가했습니다. 42일째에, 콜라겐 발현이 유의하게 증가하였고, BA 조직에서 상당한 콜라겐 침착이 관찰되었다.
CK19 양성 세포는 12일째에 관찰되었다. 42일째에 CK19 양성 세포는 증가했지만 성숙한 담관은 거의 없었습니다. 만성 BA 마우스의 간외 담관이 차단되었고 마이크로파지의 염증성 침윤이 있었습니다.
간의 ALT 및 ALP 수치는 정상 대조군보다 만성 BA 그룹에서 더 높았습니다. 총 빌리루빈, 직접 빌리루빈 및 간접 빌리루빈 수치가 증가하여 BA의 만성 섬유증 단계에서 간 기능이 유의하게 감소했음을 나타냅니다. 주사는 마우스 간을 뚫지 않도록 주의해서 해야 합니다. 주사 후 약 10 초 동안 마우스의 상태를 관찰하고 상처에서 혈액을 제거해야합니다.
