이 프로토콜은 마우스에서 1 차적인 멜라닌세포 및 섬유아세포 배양을 생성하는 신속하고 간단한 방법을 설명합니다. 이 기술은 표피와 진피를 분리할 필요가 없기 때문에 최소한의 훈련으로 신속하고 일관되게 수행 될 수 있습니다. 이 방법은 칼멜라닌세포및 섬유아세포 생물학을 연구하는 데 사용될 수 있다.
이 문화에 있는 실험은 암, 상처 치유 및 착색 결함에 관련있는 통찰력을 제공할 수 있습니다. 시작하기 전에 필요한 시약을 모두 준비하고 수조의 온도를 확인하십시오. 여러 샘플을 처리하려는 경우 표 1의 시약 크기 조정 가이드를 참조하십시오.
이 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 브랜든 머피 (Brandon Murphy)가 될 것입니다. 라미나르 플로우 캐비닛에서 70%에탄올이 함유된 멸균 페트리 접시에 각 안락사 마우스의 트렁크를 짧게 굴려 보입니다. 에탄올에서 마우스를 제거하고 빈 멸균 페트리 접시에 넣습니다.
다음으로, 70%에탄올로 외과 가위를 살균합니다. 이 가위를 사용하여 목에서 시작하여 꼬리까지 트렁크의 복부 측의 피부에 절개를 합니다. 멸균 집게를 사용하여 마우스의 트렁크에서 피부를 벗겨내고 피부의 진피 측면에서 과도한 지방 조직을 제거합니다.
피부, 진피 측면을 아래로 놓고 1X 항생제 항진균 용액 3 밀리리터를 포함하는 6 개의 우물 접시에 넣습니다. 실온에서 2~3분 동안 배양하세요. 그런 다음 티슈 헬기를 켜고 여기에 표시된 것과 설정을 조정합니다.
티슈 헬기 블레이드를 설치하고 기계를 작동 할 때주의하십시오. 피부, 진미 측면을 아래로, 멸균 조직 헬기 접시에 옮기고 조직 헬기를 통해 피부를 완전히 세 번 전달합니다. 그 후 균질화된 피부를 피부 소화 완충제 3밀리리터를 함유한 멸균 15 밀리리터 원내 튜브로 이송한다.
P1000 마이크로 파이펫을 사용하여 10~15회 위아래로 피펫팅하여 생성된 서스펜션을 혼합합니다. 원추형 튜브를 캡을 씌우고 15분 동안 섭씨 37도의 수조에서 샘플을 배양하여 3~5분마다 튜브를 반전시급합니다. 다음으로, 실온에서 750배 G의 스윙 버킷 로터에서 튜브를 원심분리하여 5분간 피부 모성전의 세포를 펠릿합니다.
P1000 마이크로 파이펫을 사용하여 피부 소화 버퍼를 천천히 완전히 제거하여 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오. 모든 피부 다이제스트 버퍼를 흡인해야합니다. 문제가 있는 경우, 멜라노세포 제의 2~3마일로 세포 펠릿을 씻고 원심분리를 반복하고 과도한 피부 다이제스트 버퍼를 제거하십시오.
그런 다음 P1000 파이펫으로 15~20회 위아래로 피펫을 하여 멜라닌세포 매체의 1밀리리터로 셀 펠릿을 철저히 재보페한다. 멜라노세포 매체1밀리리터를 함유한 6개의 웰 디쉬에서 코팅되지 않은 웰으로 생성된 세포 용액을 현명하게 전달합니다. 도금된 피부 균질은 37°C에서 37°C의 인큐베이터에서 40분 동안 5%의 이산화탄소를 배양합니다.
그 후, 코팅되지 않은 접시에서 6개의 웰 디쉬를 코팅한 미리 세척된 콜라겐 의 우물 로 문화 상퍼를 옮겨줍니다. 최종 농도가 밀리리터당 100 나노그램인 것을 미디어에 G-418을 추가합니다. 섬유아세포 중의 2밀리리터를 코팅되지 않은 접시 한 웰에 추가하여 섬유아세포가 함유되어 있습니다.
2배 배양자는 이산화탄소 5%로 섭씨 37도에서 조직 배양인에서 하룻밤 사이에 배양합니다. 16~24시간 의 배양 후, 각 문화권에서 언론과 파편을 별도로 흡인시합니다. 각 세척에 대해 PBS 1밀리리터를 사용하여 각 접시를 두 번 씻으시다.
그런 다음, 멜라닌세포 배양에 신선한 멜라닌세포 배지의 2밀리리터를 추가하고 섬유아세포 문화에 신선한 섬유아세포 배지 의 2밀리리터를 추가합니다. 이 연구에서는 섬유아세포와 멜라닌세포 배양이 동일한 피부 샘플에서 동시에 생성됩니다. 균질화된 피부가 처음 도금되면 미디어가 흐린 것처럼 보입니다.
그러나, 배양 후 더 큰 세포 대기업 및 부착 세포 섬유 아세포는 접시에서 볼 수 있게 된다. 배양으로부터의 비부착 세포는 콜라겐 코팅 된 접시로 옮겨지고 G-418로 처리됩니다. G-418에 의해 살해된 섬유아세포는 다음 5일 동안 멜라닌세포 배양 배지에 떠 있는 것을 볼 수 있다.
배양에서 4~5일 후에, 도금된 멜라닌세포는 멜라닌세포 과립을 가진 수지상 표현형에 걸리기 시작합니다. 이 표현형은 패혈을 지속하고 오염각세포의 클러스터가 손실됩니다. 결과 멜라닌세포 및 섬유아세포 배양의 순도는 유동 세포측정을 사용하여 확인된다.
멜라노세포 마커 GP100의 발현은 멜라닌세포 배양에 특이적이며, 섬유아세포 마커인 FSP1은 1차 섬유아세포에서만 발견된다. 제어 C59 각질 세포는 각질 세포 마커, K14에 대해 양성 얼룩을 두는 유일한 배양이다. 농축 된 멜라닌 세포 문화를 확립하는 데 걸리는 시간을 결정하기 위해 추가 분석이 수행됩니다.
GP100 양성 세포는 배양에서 10 일 후에 4 일째및 피크에 나타나기 시작합니다. 이 절차는 체외 및 높은 처리량 omic assays의 다양한 멜라닌세포 및 섬유아세포 배양을 급속하게 생성하는 데 사용될 수 있다.
