이 연구는 NIH의 교내 연구 프로그램, NIDCD에서 MH까지 부분적으로 지원되었습니다 (DC000088)

모든 동물 실험 및 절차는 국립 신경 질환 및 뇌졸중 연구소의 동물 관리 및 사용 위원회와 국립 보건원의 국립 청각 장애 및 기타 의사소통 장애 연구소에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 모든 실험 프로토콜은 국립 신경 질환 및 뇌졸중 연구소의 동물 관리 및 사용 위원회와 국립 보건원의 국립 난청 및 기타 의사소통 장애 연구소의 승인을 받았습니다. 모든 방법은 국립 신경 질환 및 뇌졸중 연구소의 동물 관리 및 사용위원회와 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 국립 청각 장애 및 기타 의사 소통 장애 연구소 (National Institute on Deafness and Other Communication Disorders)의 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.
1. 동물 안락사
<ol><li>체중이 15-20g인 C57BL/6J 또는 Kcnj10-ZsGreen 형질전환 마우스, 출생 후 30+(P30+)를 사용하십시오.</li>
	<li>성인 마우스(P30세 이상)를 승인된 프로토콜(여기서는CO2 질식)을 사용하여 안락사시킨다. 2 차 단계로 참수를 수행하십시오. 참고: 면역염색의 경우 일부 항체는 SV의 모세혈관에서 혈액에 대한 비특이적 결합으로 인해 배경 신호를 가질 수 있습니다. 고정제를 사용한 심장 관류는 SV의 모세혈관에서 혈액을 제거하여 이 문제를 해결할 수 있습니다. 그러나 대부분의 항체는 이 방법 없이 좋은 결과를 얻을 수 있으며 이 프로토콜에서는 다루지 않습니다.</li>
</ol>2. 뼈 미로 노출
<ol><li>70% 에탄올을 뿌리고 종이 타월로 닦아 마우스를 청소합니다. 오염 위험을 줄이기 위해 머리 부분에 특히주의하십시오. 피부를 코 쪽으로 당겨 두개골에서 피부를 제거합니다.</li>
	<li>날카로운 가위를 사용하여 중간 시상면을 따라 두개골을 분할하여 왼쪽과 오른쪽 부분을 분리합니다.</li>
	<li>두개골에서 뇌를 제거하여 뼈 미로를 드러냅니다.</li>
</ol>3. 내이 추출
<ol><li>측두골 내의 내이를 확인하고(그림 2A) #55 집게를 사용하여 뇌신경을 긁어냅니다. 알림: 사용자는 두 번째 #55 집게 세트를 사용하여 주로 사용하지 않는 손으로 표본을 안정시켜야 합니다. 검체의 중요한 영역을 피하는 경우(예: 달팽이관을 부수지 마십시오) 해부 내내 안정화 집게로 표본의 다른 영역을 잡을 수 있습니다.</li>
	<li>#55 집게를 사용하여 수포와 캡슐을 해부하여 주변 뼈에서 분리합니다. 내이 표면에 남아 있는 연조직을 제거합니다.</li>
	<li>검체를 1x 차가운 PBS(인산염 완충 식염수), pH 7.4가 들어 있는 투명한 조직 배양 접시에 옮기고 해부 범위 아래에 놓습니다(그림 2B).</li>
</ol>4. SV 해부
알림: 연습을 통해 SV를 리본을 닮은 하나의 긴 조각으로 해부할 수 있습니다. SV는 깨지기 쉽기 때문에 조각으로 부서지면 함께 보관할 수 있습니다. 대안적으로, 이들은 그들의 차례에 따라 개별적으로 라벨링된 웰(예를 들어, 기저, 중간, 정점)에 저장될 수 있다.
<ol><li>해부 스코프 광원을 이동할 수 있는 경우 접시 위에 하나의 조명을 배치하고 측면에서 두 번째 광원을 해부 표면과 평행하게 놓습니다. 이것은 달팽이관 뼈 아래 조직의 더 나은 대조를 허용합니다.</li>
	<li>#55 집게를 사용하여 달팽이관이 위를 향하도록 하여 전정 부분으로 표본을 잡습니다.</li>
	<li>#55 집게를 사용하여 정점의 달팽이관 뼈를 뚫습니다. 참고: #5 겸자는 #55보다 두껍고 뼈를 부러뜨리는 데 사용할 수 있지만 크기/강도의 증가는 집게의 섬세함과 작은 조직을 조작하는 능력을 희생합니다. 더 섬세한 집게에 발생할 수 있는 손상을 방지하기 위해 inox 또는 dumostar와 같은 재료로 만든 집게를 사용하는 것이 좋습니다. SV가 손상되지 않도록 집게를 뼈 아래로 너무 깊숙이 밀어 넣지 마십시오.</li>
	<li>#55 집게를 사용하여 정점 회전을 따라 긁어내고(그림 2C) 부드러운 힘을 가하여 바깥쪽 뼈층의 작은 조각을 떼어냅니다. 뼈를 부드럽게 들어 올려 측면 벽에서 분리하십시오. 참고: 이 해부는 "달팽이관에서 SV를 해부"하는 것이 아니라 "SV에서 모든 것을 제거하는 것"으로 생각하는 것이 도움이 될 수 있습니다.</li>
	<li>#55 집게를 계속 사용하여 정점 및 중간 회전에서 달팽이관 뼈 조각을 제거합니다(그림 2D,E). 측면 벽을 부드럽게 아래로 밀고 중간 회전을 향해 뼈 벽 조각을 들어 올려 제거하여 정점 및 중간 회전의 측면 벽을 노출시킵니다.</li>
	<li>#55 집게를 계속 사용하여 정점 회전 측벽을 옆으로 부드럽게 밀어 나선형 신경절을 노출시킵니다. 바깥 쪽 유모 세포층을 따라 나선형 신경절에서 정점 및 중간 회전의 측벽을 분리합니다. 달팽이관 내부에서 나선형 신경절 조각을 제거합니다. 알림: #55 집게는 더 작고 작고 섬세한 조직을 조작할 때 이점을 제공합니다. 구부러지거나 손상되지 않도록 각별한 주의를 기울여야 합니다.</li>
	<li>기저부의 외벽에 더 잘 접근하려면 #55 집게를 사용하여 측두골의 전정 부분에서 달팽이관을 분리합니다. #55 집게를 원형 타원형 창에 넣고 현관 쪽으로 아래로 밉니다. 달팽이관이 분리됩니다. 내이의 전정 부분을 제거하십시오.</li>
	<li>#55 집게를 계속 사용하여 중간 회전 영역부터 시작하여 기초 달팽이관 뼈 조각을 제거합니다. 뼈 아래의 측면 벽 층을 부드럽게 밀어 분리합니다.</li>
	<li>조직을 들어 올리고 부드럽게 잡아 당겨 측벽의 가장 먼 기저 부분을 제거하십시오. 이 부위의 뼈는 너무 두꺼워서 아래의 연조직을 손상시키지 않고 제거할 수 없습니다.</li>
	<li>이제 외벽의 기저부를 분리한 상태에서 달팽이관에서 외벽을 최대한 분리합니다. 이것은 측면 벽을 따라 #55 집게를 추적하여 수행할 수 있습니다. 뼈와 나머지 측벽 사이의 집게를 부드럽게 닦습니다. 이것은 사용자가 경험이 있는 경우 한 조각으로 정점까지 수행할 수 있습니다. 측벽을 새 PBS로 옮깁니다. 참고: SV의 큰 조각은 이미징하기가 더 쉬울 수 있지만 조직의 섬세한 특성을 감안할 때 더 작은 조각을 촬영할 수 있으며(그림 2F, G) 크기에 따라 이미징에도 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>#55 집게를 사용하여 측면 벽을 평평하게 놓습니다. SV는 측벽의 내부에 더 어두운 조직층으로 보여야 합니다. 참고: 사용자는 특히 정점 끝에 가까울수록 SV 조직의 일부가 해부 내내 측면 벽에서 우연히 분리되는 것을 발견할 수 있습니다.</li>
	<li>SV 레이어를 부드럽게 들어 올려 기저부의 측면 벽에서 분리합니다(그림 2H). 분리된 SV를 부드럽게 옆으로 밀고 집게를 측면 벽의 정점 끝 쪽으로 더 이동하여 가능하면 SV를 하나의 긴 리본으로 분리합니다(그림 2I). 집게로 SV를 쥐어 당기지 마십시오. 조직이 너무 약해서 잡을 수 없는 경우 칼라지온 큐렛과 같은 조직 국자를 사용하여 수집할 수 있습니다. 알림: SV 이동은 손실되지 않도록 항상 광학 현미경으로 수행해야 합니다. 집게를 사용하여 잡을 때는 손상의 위험이 있으므로 항상 주의하십시오. 사용자는 chalazion 큐레트를 사용하면 SV 조직 손상 위험을 완화할 수 있습니다. 단일 핵 시퀀싱의 경우 섹션 5로 진행합니다. SV 면역염색의 경우, 섹션 7로 진행한다.</li>
</ol>5. SV 단핵 현탁액
참고: 이 프로토콜은 특히 공개된 제조업체의 단일 핵 현탁액 프로토콜에서 SV 조직에 맞게 조정되었습니다. 상이한 제조업자로부터의 플랫폼들이 사용될 수 있다31. 플랫폼별 변형을 감안할 때 장비와 함께 제공되는 제조업체별 프로토콜을 검토하는 것이 좋습니다. sNuc-Seq에 대한 최적의 결과를 얻고 RNA 분해를 최소화하려면 조직 절개가 빠를수록 좋습니다(안락사 후 15-20분 이내 권장). 한 번에 한 마리씩 해부할 준비가 되었을 때만 안락사시키는 것이 도움이 될 수 있습니다. 여러 사람이 동시에 해부 작업을 하면 분해 시간도 없앨 수 있습니다(예: 한 실험실 직원이 왼쪽 귀에서 작업하고 다른 실험실 직원이 오른쪽 귀에서 작업).
<ol><li>SV 조직이 sNuc-Seq에 사용될 경우, 조직을 차가운 용해 완충액(10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mMMgCl2, 0.005% nonidet P40 in nuclease free water)에 넣는다. 알림: 해부 직후 시퀀싱을 수행해야 하는 경우 프로토콜을 계속하십시오. 프로토콜을 일시 중지하려는 경우 SV를 RNAlater에 배치하여 SV 보존이 가능합니다. 4 °C에서 밤새 보관한 다음 액체 질소에서 급속 냉동하고 사용할 준비가 될 때까지 -80 °C에서 보관하십시오. 사용할 준비가 되면 PBS에서 각각 5분 동안 해동하고 세척한 다음 균질화를 진행합니다(단계 5.2).</li>
	<li>얼음 위에서 2-10회 스트로크로 2mL dounce 균질화기에서 조직을 균질화합니다. 알림: 유리 실린더는 유리관 바닥에 수동으로 접촉하여 SV를 조각화합니다. SV는 섬세하므로 일반적으로 20 스트로크로 성공적인 균질화를 달성합니다.</li>
	<li>얼음 위에서 25분 동안 티슈를 녹입니다. 참고: 용해 시간은 조직 유형에 따라 다릅니다. SV 조직에서의 25분 용해는 낮은 세포 생존율(4% 미만)을 달성할 수 있지만, 세포 생존율이 너무 높은 경우 시간을 조정할 수 있다(단계 5.8).</li>
	<li>30μm 필터를 통해 여과하고 여과액을 4°C에서 5분 동안 500 x g 로 회전시킵니다.</li>
	<li>상층액을 제거하고 세포 펠릿을 1mL의 핵 세척 및 재현탁 완충액(1x PBS, 1% 소 혈청 알부민[BSA], 0.2U/μL RNase 억제제)에 재현탁합니다.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 10 μm 필터 및 500 x g 에서 원심분리기를 통해 세포를 여과한다.</li>
	<li>상층액을 제거하고 50 μL의 핵 세척 및 재현탁 완충액에 재현탁합니다.</li>
	<li>세포 계수기 및 트리판 블루 염색을 사용하여 핵을 계수합니다. 세포 계수를 위해 5 μL의 세포 현탁액을 50 μL의 1x PBS로 희석합니다. 이 시점에서 생존력은 최소(3%-4%)여야 합니다. 생존율이 더 높은 것으로 판명되면 5.3단계(용해)에 대한 프로토콜을 조정하고 용해 시간을 표준화하여 세포의 적절한 용해를 보장합니다. 참고: 단일 핵 제제에서 세포 생존율이 높다는 것은 원하는 것보다 더 많은 온전한 세포가 있고 추가 소화가 필요할 수 있음을 의미합니다.</li>
	<li>원하는 핵 밀도를 가진 샘플을 제조업체의 장치/칩에 로드합니다(제조업체 가이드 참조). 이제 단일 핵 캡처가 준비되었습니다. 참고: 성인 마우스 SV 1마리에서 일반적으로 150,000 nuclei/mL 농도의 현탁액 50μL가 달성됩니다.</li>
</ol>6. SV 단일 핵 시퀀싱
<ol><li>시퀀싱을 위해 샘플을 핵심 시설로 보냅니다. 참고: 프로토콜의 이 부분은 (1) 겔 비드-인 에멀젼(GEM) 생성 및 바코드, (2) GEM-RT 후 클린업 및 cDNA 증폭, (3) 3' 유전자 발현 라이브러리 구축의 일반적인 단계를 따릅니다. sNuc-Seq 프로토콜의 나머지 부분은 비교적 길기 때문에 리더는 제조업체별 프로토콜을 사용하는 것이 좋습니다. 제조업체 가이드에는 특정 세부 정보 및 함께 제공되는 이미지와 함께 단계가 설명되어 있습니다. 제조업체 웹 사이트에 '방법' 비디오가 있을 수도 있습니다. 생성된 데이터세트는 균일 매니폴드 근사 및 투영(UMAP; 그림 3). 많은 랩에서는 사용자를 위해 이 프로토콜을 수행할 수 있는 시퀀싱 코어를 사용합니다.</li>
</ol>7. SV 면역염색 및 조직 장착
<ol><li>조직을 면역염색에 사용할 경우 24웰 플레이트로 옮기고 1x PBS에 4% 파라포름알데히드(PFA) 200μL에 담근 후 실온에서 20분 동안 배양합니다. 알림: 현미경으로 모든 액체 제거, 세척 및 면역염색을 수행하는 것이 도움이 됩니다. 조직을 피펫팅하는 동안 시각화하면 액체를 제거하는 동안 조직이 우발적으로 손실되지 않도록 할 수 있습니다. 항체 및 세척액의 부피는 부피가 SV 조직을 용액 내에 잠길 수 있을 만큼 충분히 큰 한 조정될 수 있다.</li>
	<li>고정 단계 후, 낮은 (30-50) RPM의 오비탈 쉐이커 상에서 각각 5분 동안 4°C에서 1x PBS(약 500 μL)에서 2회의 짧은 세척을 수행하여 PFA를 제거한다. 보관하는 경우, 조직은 4°C에서 1x PBS에 저장될 수 있다.</li>
	<li>PBS를 제거하고 약 300μL의 PBS-T 용액(10% 소 태아 혈청이 포함된 1x PBS 중 0.05Tween20)에서 실온에서 최소 1시간 동안 투과화 및 차단합니다. 참고: 1차 및 2차 항체는 이 차단 용액에 희석해야 합니다.</li>
	<li>사용된 특정 항체의 사양에 따라 1차 항체로 조직을 염색하고, 보통 4°C에서 하룻밤 동안 소독합니다. 나머지 PBS를 제거하고 희석된 1차 항체를 추가합니다. 알림: 희석은 제조업체 제안, 게시된 데이터, 이전 경험 등을 기반으로 선택해야 합니다. 일반적으로 테스트할 첫 번째 농도는 1:100-200 희석입니다. 본 논문에 제시된 예에서 GS-IB4 및 DAPI 항체를 각각 1:200으로 희석하였다. 하나 이상의 단백질에 대해 염색하는 경우, 각 1차 항체가 2차 항체의 교차 반응성을 피하기 위해 다른 숙주를 갖는 한 여러 1차 항체를 동일한 용액에 결합할 수 있습니다.</li>
	<li>약 500μL의 1x PBS를 사용하여 낮은 RPM의 오비탈 셰이커에서 각각 10분 동안 두 번 사용하여 조직에서 1차 항체를 세척합니다. 알림: SV 조직이 용액에 잠기고 웰 측면에 달라붙지 않도록 계속 확인하십시오.</li>
	<li>사용된 특정 항체의 사양에 따라 2차 항체로 염색하고, 일반적으로 낮은 RPM의 오비탈 셰이커 상에서 실온에서 2시간 동안 염색합니다. 형광 태그된 2차 항체가 빛으로부터 보호되도록 24웰 플레이트를 덮습니다. 참고: 하나 이상의 2차 항체가 필요한 경우 2차 항체를 동일한 용액에 결합합니다. 교차 라벨링을 피하십시오.</li>
	<li>약 500 μL의 1x PBS를 사용하여 낮은 RPM의 오비탈 쉐이커에서 각각 5분 동안 4회 조직으로부터 2차 항체를 세척한다. 빛으로부터 보호하기 위해 24웰 플레이트를 덮어 두십시오.</li>
	<li>25mm 축을 따라 18mm x 18mm 크기의 작은 유리 커버슬립보다 작은 접착제 줄무늬 두 개를 배치하여 더 큰 마이크로슬라이드(75mm x 25mm)를 준비합니다. 접착제 줄무늬 사이에 장착 시약 한 방울(약 50μL)을 놓습니다. 알림: 접착제는 두 번째 커버슬립을 맨 위에 놓을 때 SV 조직 샘플이 안전하게 존재할 수 있지만 제자리에 계속 유지되도록 소량의 수직 공간을 만듭니다. 줄무늬 두께는 30-40 미크론이지만 형태를 보존하기 위해 유리 표면 사이의 조직을 압착하는 것은 피해야 합니다. 대안적으로, 투명 테이프가 또한 사용될 수 있다.</li>
	<li>#55 집게를 사용하여 SV의 한쪽 끝에서 가능한 한 적은 조직을 잡고 PBS에서 더 큰 마이크로슬라이드(75mm x 25mm)의 장착 시약 드롭으로 옮깁니다. 작은 유리 커버슬립(18mm x 18mm)의 한쪽 끝을 접착제 한 줄무늬가 놓인 슬라이드에 놓고 기포가 생기지 않도록 부드럽게 놓습니다. 커버슬립은 다른 접착제 줄무늬로 떨어지고 SV 조직을 덮습니다.</li>
	<li>마운트의 각 모서리에 투명 매니큐어 한 방울을 두드려 마운트를 밀봉합니다. 유리 커버슬립에 그에 따라 표본을 표시하여 시각화 필드에서 멀리 떨어뜨립니다. 이제 컨포칼 현미경 검사를 사용할 준비가 되었습니다(그림 4).</li>
	<li>해부 현미경을 사용하여 SV 조직을 시각화하여 기포 근처에 있지 않고 평평하게 놓여 있는지 확인합니다. SV 조직의 방향이 올바르지 않은 경우 사용자는 기포를 밀어내거나 더 작은 유리 커버슬립을 조심스럽게 제거하고 SV의 위치를 변경할 수 있습니다. 유리 커버슬립이 깨지지 않도록 부드럽게 해야 합니다.</li>
</ol>

Single-nucleus sequencing 또는 immunostaining을 위한 Stria Vascularis 미세절개

<ol>
	<li>Bosher, S. K., Warren, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+electrochemistry+of+the+cochlear+endolymph+of+the+rat:+a+quantitative+study+of+its+electrical+potential+and+ionic+composition+as+determined+by+means+of+flame+spectrophotometry.">Observations on the electrochemistry of the cochlear endolymph of the rat: a quantitative study of its electrical potential and ionic composition as determined by means of flame spectrophotometry.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B. 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The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus.</a> Pflugers Archiv. 459 (4), 521-533 (2010).</li><li>Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+significance+of+channels+and+transporters+expressed+in+the+inner+ear+and+kidney.">Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney.</a> American Journal of Physiology. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+irreversible+hearing+loss+is+caused+by+stria+vascularis+degeneration+in+an+Slc26a4-insufficient+mouse+model+of+large+vestibular+aqueduct+syndrome.">Progressive irreversible hearing loss is caused by stria vascularis degeneration in an Slc26a4-insufficient mouse model of large vestibular aqueduct syndrome.</a> Neuroscience. 310, 188-197 (2015).</li><li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+rare+spindle+and+root+cell+transcriptional+profiles+in+the+stria+vascularis+of+the+adult+mouse+cochlea.">Characterization of rare spindle and root cell transcriptional profiles in the stria vascularis of the adult mouse cochlea.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18100 (2020).</li><li>Gow, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deafness+in+claudin+11-null+mice+reveals+the+critical+contribution+of+basal+cell+tight+junctions+to+stria+vascularis+function.">Deafness in claudin 11-null mice reveals the critical contribution of basal cell tight junctions to stria vascularis function.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (32), 7051-7062 (2004).</li><li>Chang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virally+mediated+Kcnq1+gene+replacement+therapy+in+the+immature+scala+media+restores+hearing+in+a+mouse+model+of+human+Jervell+and+Lange-Nielsen+deafness+syndrome.">Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (8), 1077-1086 (2015).</li><li>Faridi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+and+phenotypic+spectra+of+KCNE1+deficiency+in+Jervell+and+Lange-Nielsen+Syndrome+and+Romano-Ward+Syndrome.">Mutational and phenotypic spectra of KCNE1 deficiency in Jervell and Lange-Nielsen Syndrome and Romano-Ward Syndrome.</a> Human Mutation. 40 (2), 162-176 (2019).</li><li>Wangemann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+KCNJ10+protein+expression+abolishes+endocochlear+potential+and+causes+deafness+in+Pendred+syndrome+mouse+model.">Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model.</a> BMC Medicine. 2, 30 (2004).</li><li>Kitajiri, S. -. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+single-cell+and+spatial+transcriptomics+to+elucidate+intercellular+tissue+dynamics.">Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics.</a> Nature Reviews Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).</li><li>Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+single-nucleus+RNA+sequencing+in+different+cell+types+and+tissues.">Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues.</a> Journal of Pathology and Translational Medicine. 57 (1), 52-59 (2023).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visuazlied Experiments. (107), e53561 (2016).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

단일 세포 시퀀싱이 등장하기 전에 많은 연구자들은 벌크 조직 분석을 사용하여 세포 전체에 걸쳐 평균화된 전사체만 분석할 수 있었습니다. 특히, single-cell 및 sNuc-Seq는 각각 단일 세포 또는 단일 핵의 전사체를 분리하는 것을 가능하게 하였다32. 이 경우, 단일핵 전사체는 방추 세포(30) 뿐만 아니라 변연, 중간 및 기저 세포에 대해 확인될 수 있다. 이를 통해 SV ?...

달팽이관은 3개의 유체로 채워진 챔버, 스칼라 현관, 스칼라 중막 및 스칼라 고막으로 구성됩니다. 스칼라 현정과 스칼라 고막은 각각 고농도의 나트륨(138mM)과 낮은 농도의 칼륨(6.8mM)을 함유하고 있는 외림프를 함유하고 있습니다.1. 스칼라 배지는 고농도의 칼륨 (154 mM)과 낮은 농도의 나트륨 (0.91 mM)을 갖는 내 림프를 함유하고 있습니다 1,2,3. 이러한 이온 농도의 차이는 달팽이관 내 전위(EP)라고 할 수 있으며, 주로 달팽이관 4,5,6,7,8,9,10,11의 측벽을 따라 선조체 혈관(SV)의 다양한 이온 채널과 간극 접합부를 통한 칼륨 이온의 이동에 의해 생성됩니다 . SV는 달팽이관 외벽의 내측을 둘러싸고 있으며 변연, 중간 및 기저 세포의 세 가지 주요 세포 유형을 포함하는 이질적이고 혈관이 많이 형성된 조직입니다12(그림 1).
변연 세포는 단단한 접합부로 연결되어 SV의 가장 중간 표면을 형성합니다. 정단막은 스칼라 매막의 내림프를 향하고 KCNE1/KCNQ1, SLC12A2 및 Na+-K+-ATPase(NKA)5,10,13,14를 포함한 다양한 채널을 사용하여 내림프로의 칼륨 이온 수송에 기여합니다. 중간 세포는 변연부와 기저 세포 사이에 존재하며 KCNJ10 (Kir 4.1) 15,16을 사용하여 SV를 통한 칼륨 수송을 촉진하는 색소 세포입니다. 기저 세포는 달팽이관의 외벽에 매우 근접해 있으며 나선형 인대의 섬유세포와 밀접하게 연관되어 외림프에서 칼륨 재활용을 촉진한다12. SV의 병리학은 수많은 이과적 장애에 연루되어 있다17,18. Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 및 Cldn11과 같은 주요 SV 세포 유형에서 발현되는 유전자의 돌연변이는 EP 19,20,21,22,23의 손실을 포함하여 난청 및 SV 기능 장애를 유발할 수 있습니다. 세 가지 주요 세포 유형 외에도 방추 세포 22, 뿌리 세포12,24, 대식세포 25, 혈관주위세포 26 및 내피 세포 27과 같이 SV에서 덜 연구된 다른 세포 유형이 있으며, 이는 이온 항상성 및 EP 28의 생성과 관련된 역할이 불완전하게 정의되어 있습니다.
벌크 RNA-염기서열분석과 비교하여, 단일-핵 RNA-염기서열분석(sNuc-Seq)은 세포 그룹29에 걸친 mRNA의 평균이 아닌 세포 이질성에 대한 정보를 제공하며, 이질적인 SV30을 연구할 때 특히 유용할 수 있다. 예를 들어, sNuc-Seq는 EP 생성, 청력 상실 및 메니에르병에서 방추 세포와 뿌리 세포에 역할이 있을 수 있음을 시사하는 전사 분석을 생성했다18. 다양한 SV 세포 유형의 추가 전사 특성화는 SV 관련 청력 변동 및 청력 손실의 다양한 메커니즘 및 하위 유형의 기초가 되는 병태생리학에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 이러한 섬세한 내이 구조의 수확은 최적의 조직 분석에 가장 중요합니다.
이 연구에서는 sNuc-Seq 또는 면역염색을 위해 성인 마우스 달팽이관에서 선조체 혈관에 접근하고 분리하기 위한 미세 해부 접근법이 설명됩니다. 성인 마우스 SV의 해부는 다양한 SV 세포 유형을 이해하고 청력에서의 역할을 추가로 특성화하는 데 필요합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10-&#181;m filter (Polyethylenterephthalat)</td>
			<td >PluriSelect</td>
			<td >#43-50010-01</td>
			<td >Filter tissue during sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >18 x 18 mm cover glass</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-541A</td>
			<td >Cover slip to mount SV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30-&#181;m filter (Polyethylenterephthalat)</td>
			<td >PluriSelect</td>
			<td >#43-50030-03</td>
			<td >Filter tissue during sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide</td>
			<td >Daigger</td>
			<td >EF15978Z</td>
			<td >Microslide to mount SV on</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL/6J Mice</td>
			<td >The Jackson Laboratory</td>
			<td >RRID: IMSR_JAX:000664</td>
			<td >General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Counter</td>
			<td >Logos Biosystems</td>
			<td >L20001</td>
			<td >Used for cell counting</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chalizon curette 5&#39;&#39;, size 3 2.5 mm</td>
			<td >Biomedical Research Instruments</td>
			<td >15-1020</td>
			<td >Used to transfer SV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chromium Next GEM single Cell 3&#39; GEM Kit v3.1</td>
			<td >Chromium</td>
			<td >PN-1000141</td>
			<td >Generates single cell 3&#39; gene expression libraries</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear nail polish</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >NC1849418</td>
			<td >Used for sealing SV mount</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well</td>
			<td >Corning</td>
			<td >08-772B</td>
			<td >Culture dish used to hold specimen during dissection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >D1306, RRID: AB_2629482</td>
			<td >Stain used for nucleus labeling</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dounce homogenizer</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D8938</td>
			<td >Used to homogenize tissue for sNuc-seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dumont #5 Forceps</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >11252-30</td>
			<td >General forceps for dissection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dumont #55 Forceps</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >11255-20</td>
			<td >Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >16000044</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glue stick</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >NC0691392</td>
			<td >Used for mounting SV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GS-IB4 Antibody</td>
			<td >Molecular Probes</td>
			<td >I21411, RRID: AB-2314662</td>
			<td >Antibody used for capillary labeling</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >KCNJ10-ZsGreen Mice</td>
			<td >n/a</td>
			<td >n/a</td>
			<td >Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MgCl2</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >AM9530G</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mounting reagent</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >#S36940</td>
			<td >Mounting reagent for SV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Multiwell 24 well plate</td>
			<td >Corning</td>
			<td >#353047</td>
			<td >Plate used for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >AAJ216183</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nonidet P40</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >9-16-45-9</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease free water</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >4387936</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Orbital shaker</td>
			<td >Silent Shake</td>
			<td >SYC-2102A</td>
			<td >Used for steps of immunostaining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >J61196.AP</td>
			<td >Used for steps of immunostaining and dissection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNA Later</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >AM7021</td>
			<td >Used for preservation of SV for sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scizzors</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >14058-09</td>
			<td >Used for splitting mouse skull</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-HCl</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >15506017</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan blue stain</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15250061</td>
			<td >Used for cell counting</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tween20</td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td >AAJ20605AP&#160;</td>
			<td >Used for steps of sNuc-Seq</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >n/a</td>
			<td >Microscope used for dissections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of adult mouse stria vascularis for single-nucleus sequencing or immunostaining

선조체 혈관에 의해 생성되는 내와우 전위는 적절한 유모 세포 기계 형질도입과 궁극적으로 청력에 도움이 되는 환경을 유지하는 데 필수적입니다. 선조체 혈관의 병리는 청력 저하를 초래할 수 있습니다. 성인 선조체 혈관의 해부는 집중된 단일 핵 포획 및 후속 단일 핵 시퀀싱 및 면역 염색을 허용합니다. 이러한 기술은 단일 세포 수준에서 선조체 혈관 병태생리학을 연구하는 데 사용됩니다. 
단일 핵 시퀀싱은 선조체 혈관의 전사 분석 설정에 사용할 수 있습니다. 한편, 면역염색은 특정 세포 집단을 식별하는 데 계속 유용합니다. 두 방법 모두 전제 조건으로 적절한 선조체 혈관 박리가 필요하며, 이는 기술적으로 어려울 수 있습니다.

The cochlea consists of three fluid filled chambers, the scala vestibuli, scala media, and scala tympani. The scala vestibuli and scala tympani each contain perilymph, which has a high concentration of sodium (138 mM) and a low concentration of potassium (6.8 mM)1. The scala media contains endolymph, which has a high concentration of potassium (154 mM) and a low concentration of sodium (0.91 mM)1,2,3. This difference in ion concentration can be referred to as the endocochlear potential (EP), and is primarily generated by the movement of potassium ions through various ion channels and gap junctions in the stria vascularis (SV) along the lateral wall of the cochlea4,5,6,7,8,9,10,11. The SV is a heterogenous, highly vascularized tissue that lines the medial aspect of the lateral wall of the cochlea and contains three main cell types: marginal, intermediate, and basal cells12 (Figure 1).
Marginal cells are connected by tight junctions to form the most medial surface of the SV. The apical membrane faces the endolymph of the scala media and contributes to potassium ion transport into the endolymph using various channels, including KCNE1/KCNQ1, SLC12A2, and Na+-K+-ATPase (NKA)5,10,13,14. Intermediate cells are pigmented cells that reside between marginal and basal cells and facilitate potassium transport through the SV using KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. Basal cells lie in close proximity to the lateral wall of the cochlea and are closely associated with fibrocytes of the spiral ligament to promote potassium recycling from the perilymph12. Pathology of the SV has been implicated in numerous otologic disorders17,18. Mutations in genes expressed in the major SV cell types, such as Kcnq1, Kcne1, Kcnj10, and Cldn11, can cause deafness and SV dysfunction, including the loss of EP19,20,21,22,23. In addition to the three major cell types, there are other less-studied cell types in the SV, such as spindle cells22, root cells12,24, macrophages25, pericytes26, and endothelial cells27, that have incompletely defined roles involving ionic homeostasis and the generation of EP28.
In comparison to bulk RNA-sequencing, single-nuclei RNA-sequencing (sNuc-Seq) provides information about cell heterogeneity, rather than an average of mRNA across a group of cells29, and can be particularly useful when studying the heterogenous SV30. For example, sNuc-Seq has produced transcriptional analysis that suggests there may be a role for spindle and root cells in EP generation, hearing loss, and Meniere&#39;s disease18. Further transcriptional characterization of the various SV cell types can provide us with invaluable information on the pathophysiology underlying different mechanisms and subtypes of SV-related hearing fluctuation and hearing loss. The harvest of these delicate inner ear structures is of paramount importance to optimal tissue analysis.
In this study, the microdissection approach to access and isolate the stria vascularis from the adult mouse cochlea for sNuc-Seq or immunostaining is described. Dissection of the adult mouse SV is required to understand various SV cell types and further characterize their role in hearing.

저자 스포트라이트: Dissection of Adult Mouse Stria Vascularis for Single-Nucleus Sequencing or Immunostaining (단핵 염기서열분석 또는 면역염색을 위한 성체 마우스 줄무늬 혈관 절제)  

단일 핵 시퀀싱 또는 면역염색을 위한 성인 마우스 줄무늬 혈관의 해부

The stria vascularis functions to generate the endocochlear potential and regulate ion homeostasis in the cochlea. The auditory development and restoration program seeks to understand the underlying mechanisms connecting dysfunctional ion homeostasis with hearing and stability disorders, which are diseases where either fluctuation in or sudden hearing loss occurs. Work in my lab has established the transcriptional landscape of the stria vascularis and has contributed to our understanding of its importance in hearing.We have used these data to draw parallels to poorly-understood hearing and stability disorders, including Meniere's disease. This protocol enables the dissection and isolation of whole-mount stria vascularis for further molecular studies including immunohistochemistry. Given that stria vascularis cell types are intricately intertwined with one another, the use of nuclear isolation and single-nucleus RNA sequencing has facilitated our understanding of the distinct transcriptional machinery involved.

본 발명자들은 sNuc-Seq 또는 면역염색에 사용될 SV를 분리하는 방법을 제시한다. SV와 관련된 달팽이관의 관련 해부학적 구조(그림 1)는 사용자가 SV의 조직과 해부 프로토콜의 단계를 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
P30 마우스에서 SV의 미세 해부의 각 단계는 관련 비디오에 자세히 설명되어 있으며, 이 SV 해부 및 분리의 주요 단계에 대한 스냅샷...

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선조체 혈관은 달팽이관 내 전위 생성에 필수적입니다. 여기에서 우리는 단일 핵 시퀀싱 또는 면역 염색을 위한 성인 마우스 stria vascularis의 해부를 제시합니다.

Endocochlear potential, which is generated by the stria vascularis, is essential to maintain an environment conducive to appropriate hair cell ...

선조체 혈관은 달팽이관 내 전위를 생성하고 달팽이관의 이온 항상성을 조절하는 기능을 합니다. 청각 발달 및 복원 프로그램은 기능 장애 이온 항상성과 청력 및 안정성 장애를 연결하는 기본 메커니즘을 이해하고자합니다.이 장애는 청력 및 안정성 장애, 즉 청력의 변동 또는 갑작스런 난청이 발생하는 질병입니다. 내 연구실에서의 연구는 stria vascularis의 전사 환경을 확립했으며 청력에서의 중요성에 대한 우리의 이해에 기여했습니다.우리는 이 데이터를 사용하여 메니에르병을 포함하여 잘 이해되지 않은 청력 및 안정성 장애와 유사점을 도출했습니다. 이 프로토콜은 면역조직화학을 포함한 추가 분자 연구를 위해 전체 마운트 선조체 혈관의 해부 및 분리를 가능하게 합니다. 선조체 혈관 세포 유형이 서로 복잡하게 얽혀 있다는 점을 감안할 때 핵 분리 및 단일 핵 RNA 시퀀싱의 사용은 관련된 고유한 전사 기계에 대한 이해를 용이하게 했습니다.

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Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Adult Mouse Stria Vascularis for Single-Nucleus Sequencing or Immunostaining

1.3K 조회수.  National Institutes of Health. 선조체 혈관은 달팽이관 내 전위를 생성하고 달팽이관의 이온 항상성을 조절하는 기능을 합니다. 청각 발달 및 복원 프로그램은 기능 장애 이온 항상성과 청력 및 안정성 장애를 연결하는 기본 메커니즘을 이해하고자합니다.이 장애는 청력 및 안정성 장애, 즉 청력의 변동 또는 갑작스런 난청이 발생하는 질병입니다. 내 연구실에서의 연구는 stria vascularis의 전사 환경을 확립...

비디오: 저자 스포트라이트: Dissection of Adult Mouse Stria Vascularis for Single-Nucleus Sequencing or Immunostaining (단핵 염기서열분석 또는 면역염색을 위한 성체 마우스 줄무늬 혈관 절제)  

Endocochlear potential, which is generated by the stria vascularis, is essential to maintain an environment conducive to appropriate hair cell mechanotransduction and ultimately hearing. Pathologies of the stria vascularis can result in a decreased hearing. Dissection of the adult stria vascularis allows for focused single-nucleus capture and subsequent single-nucleus sequencing and immunostaining. These techniques are used to study stria vascularis pathophysiology at the single-cell level. 
Single-nucleus sequencing can be used in the setting of transcriptional analysis of the stria vascularis. Meanwhile, immunostaining continues to be useful in identifying specific populations of cells. Both methods require proper stria vascularis dissection as a prerequisite, which can prove to be technically challenging.

The stria vascularis is vital to the generation of endocochlear potential. Here, we present the dissection of the adult mouse stria vascularis for single-nucleus sequencing or immunostaining.

연구

생물학

Mouse Inner Ear Extraction and Stria Vascularis Dissection

To begin, identify the inner ear within the temporal bone of a euthanized mouse. Scrape away the cranial nerves using number 55 forceps. Then use number 55 forceps to dissect out the bulla and capsule, detaching them from surrounding bone.Remove any remaining soft tissue from the inner ear surface. For SV dissection, use number 55 forceps to hold the specimen by the vestibular portion with the cochlear facing up. Pierce through the cochlear bone at the apex using the same forceps.Scrape along the apical turn, applying gentle force to break away small pieces of the outer bone layer. Gently lift the bone and detach it from the lateral wall. Using number 55 forceps remove cochlear bone pieces from the apical and middle turns.Gently pushing down the lateral wall, pry and remove the bone wall pieces towards the middle turn to expose the lateral wall of the apical and middle turns. Push the apical turn lateral wall aside to expose the spiral ganglion. Detach the lateral wall of the apical and middle turns from the spiral ganglion along the outer hair cell layer.Then remove pieces of spiral ganglion from inside the cochlear. Detach the cochlear from the vestibular portion of the temporal bone by inserting the forceps into the round and oval window and pushing down towards the vestibule to have better access to the lateral wall of the basal turn. After the cochlear is detached remove the vestibular portion of the inner ear.Prioritize preserving as much of the strayer as possible. Continue removing til the bone of the middle turn is detached from the SV.Next, remove pieces of the remaining cochlear bone covering the basal turn. This can be accomplished by pushing the lateral wall layer under the bone to detach it.Pry and gently pull the tissue to remove the farthest basal part of the lateral wall being careful not to damage the soft tissue below. With the basal part of the lateral wall detached, separate the lateral wall from the remaining cochlear by tracing the forceps along the lateral wall. Gently brush the forceps between the bone and the remaining lateral wall until it reaches the apex.Then move the lateral wall to a fresh PBS. Lay the lateral wall flat revealing the SV as a darker layer of tissue on the internal side of the lateral wall. Gently pry the SV layer away from the lateral wall.Push aside the detached SV and advance the forceps along the lateral wall attempting to detach the SV as one long ribbon, trying not to squeeze the SV.Use a tissue scoop to collect the fragile tissue. Cochlear were dissected from adult mouse aged greater than or equal to postnatal day 30. Inner ear was extracted from the surrounding temporal bone.SV was exposed after the removal of bone covering the middle turn. The SV was fully separated from the lateral wall after dissection.

마우스 내이 추출 및 줄무늬 혈관 박리

Preparation of Stria Vascularis Single-Nucleus Suspension

Homogenize the dissected stria vascularis tissue from mouse ear in a two-milliliter Dounce homogenizer, with 10 to 20 strokes on ice. Lyse the tissue on ice for 25 minutes. Then, filter the tissue through a 30-micron filter and spin the filtrate at 500G for five minutes at four degrees Celsius.Remove the supernatant and resuspend the cell pellet in one milliliter of nuclei wash and resuspension buffer. Next, filter the cells through a 10-micron filter and centrifuge at 500G for five minutes at four degrees Celsius. Remove the supernatant and resuspend in 50 microliters of nuclei wash and resuspension buffer.After Trypan Blue staining, dilute five microliters of the cell suspension into 50 microliters of 1X PBS and count the cells. To prepare single nuclei captures, load the sample with the desired nuclear density onto the chip.

Stria Vascularis Single-Nucleus Suspension의 제조

Immunostaining of Mouse Stria Vascularis and Tissue Mounting

Prepare for immunostaining by dissecting the stria vascularis from the mouse and add the tissue to a 24-well plate containing 200 microliters of 4%paraformaldehyde in 1X PBS. Incubate the tissue for 20 minutes at room temperature. perform two short washes of 1X PBS on an orbital shaker at low RPM.Remove the PBS, then perform permeabilization and blocking for a minimum of one hour at room temperature in 300 microliters of PBST solution. Next, stain the tissue with the primary antibody overnight at four degrees Celsius. Then add a secondary antibody and incubate for two hours at room temperature on an orbital shaker at low RPM.Cover the plate to protect the fluorescently tagged secondary antibody from light. Next, prepare a larger microslide by placing two small streaks of glue along the 25 mm axis, just smaller than the 18 by 18 millimeter glass cover slip. Place one drop of mounting reagent between the glue streaks.Using number 55 forceps, gab as little tissue as possible on one end of the SV, and transfer it from PBS to the mounting reagent. Place one end of the cover slip on the slide where one streak of glue was placed. Then gently release the cover slip to avoid creating air bubbles.Seal the mount by dabbing a drop of transparent nail polish on each corner of the mount. Label the specimen on the glass cover slip, away from the visualization field. Visualize the SV tissue under a dissection microscope to ensure it is lying flat and not near any air bubbles.If the SV tissue is not oriented correctly, try to push out air bubbles or carefully remove the smaller glass cover slip and reposition the SV.A whole mount of SV from P30 mouse was prepared and confocal imaging was performed. ZsGreen expression was observed in the intermediate cells, GSIB4 labeled endothelial cells, and DAPI labeled the nuclei.