저자는 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(S10RR029545)에 도움을 준 Wade Koba, 현미경 검사에 대한 교육과 지원을 제공한 Analytical Imaging Facility의 Vera DesMarais 및 Hillary Guzik, Einstein Montefiore Cancer Center, National Cancer Institute(P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), Gruss Lipper Biophotonics Center, 암 연구를 위한 통합 이미징 프로그램, Henry Wellcome 경 박사후 연구원(221647/Z/20/Z) 및 METAvivor 경력 개발 상.

이 프로토콜에 설명된 모든 절차는 Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee의 사전 승인을 포함하여 척추동물 사용에 대한 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.
수술 전에 광전환/광전환 단백질을 발현하는 암세포를 사용하여 마우스에서 폐 전이를 생성해야 합니다. 폐 전이 생성에 대한 몇 가지 프로토콜이 발표되었습니다 26,27,28.
1. 수술 준비
<ol><li>마우스 준비(제모 및 삽관), 수술 및 회복을 위한 고유한 작업 영역을 준비합니다.</li>
	<li>오토클레이브의 모든 수술 기구를 멸균합니다. 참고: 이 수술에는 팁 전용 기술이 사용되므로 핫 비드 멸균기를 사용하여 후속 절차를 위해 기구를 다시 멸균할 수 있습니다.</li>
	<li>가열된 수술 플랫폼을 켜고 37-40°C에 도달하여 안정화되도록 합니다.</li>
	<li>5% 이소플루란으로 마취를 유도한 후 이소플루란을 3%로 낮춘다. 마취 적합성을 평가하기 위해 시술 전반에 걸쳐 주기적으로 발가락 꼬집기 검사를 수행합니다.</li>
	<li>마취된 쥐를 오른쪽 측면 욕창 위치에 놓습니다. 왼쪽 가슴/옆구리 몸통의 털( 그림 1A 참조)을 해당 부위에 제모 크림을 발라 제거합니다. 거즈나 종이 타월을 물에 적셔 머리카락과 제모 크림을 닦아냅니다. 수술 부위에서 모든 머리카락이 제거될 때까지 필요에 따라 반복합니다. 알림: 피부를 손상시킬 수 있으므로 제모 크림을 마우스에 20초 이상 두지 마십시오.</li>
	<li>22G 카테터 바닥 위 ~3mm의 이중 매듭을 2-0 실크 봉합사로 묶습니다. 2인치 길이의 꼬리를 남겨 둡니다.</li>
	<li>앞서 설명한 대로 이 카테터로 마우스를 삽관합니다29,30. 성공적인 삽관을 확인하려면 팽창 전구를 카테터 끝에 부착하고 부드럽게 짜십시오. 알림: 성공적으로 삽관된 마우스는 구근 압착으로 양측 흉부 상승을 경험하게 됩니다.</li>
	<li>삽관 카테터를 제자리에 고정하기 위해 이중 매듭으로 쥐의 주위에 2-0 실크 봉합사를 단단히 고정합니다.</li>
</ol>2. 폐를 노출시키는 수술
알림: 수술 필드의 오염을 방지하기 위해 후드 또는 층류 캐비닛에서 광변환을 포함한 수술의 모든 단계(그림 1)를 수행합니다.
<ol><li>소독 비누로 손을 씻고 새 멸균 장갑을 착용하십시오. 참고: 이 수술에는 팁 전용 기술이 사용되므로 비멸균 장갑도 사용할 수 있습니다. 비멸균 장갑은 알코올 기반 소독제로 소독하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>부프레노르핀 0.1mg/kg(0.03mg/mL)을 준비하고 진통을 위해 피하 주사합니다. 참고: 국소 통증 차단제 및 비스테로이드성 항염증제를 포함한 복합 진통제는 관심 있는 생물학을 방해하지 않을 것으로 예상되는 경우 부프레노르핀과 함께 사용해야 합니다.</li>
	<li>각막 손상을 방지하기 위해 양쪽 쥐 눈에 안과 연고를 바릅니다.</li>
	<li>가열된 수술 플랫폼의 오른쪽 측면 욕창 위치에 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>인공호흡기를 삽관 카테터에 연결합니다. 카테터를 약간만 움직여도 카테터 배치를 방해하고 환기가 잘 되지 않을 수 있으므로 카테터를 안정적으로 유지하도록 주의하십시오.</li>
	<li>안정적이고 인공호흡기로 제어되는 양측 흉부의 상승 및 하강을 관찰합니다.</li>
	<li>라벨링 테이프로 팔다리를 수술 플랫폼에 고정합니다. 쥐의 등을 따라 다른 테이프를 붙이고 등쪽 피부와 털을 수술 플랫폼에 고정하여 수술 부위를 안정화합니다(그림 1A).</li>
	<li>멸균된 수술 기구를 엽니다.</li>
	<li>클로르헥시딘 용액을 쥐의 피부에 도포하여 수술 부위를 소독합니다.</li>
	<li>흉골 왼쪽 ~7mm, 늑골하 가장자리 ~7mm 위 영역을 식별합니다. 집게로 이 부위의 피부를 들어 올리고 날카로운 미세 해부 가위를 사용하여 ~10mm의 원을 절개하고 피부만 자르도록 주의합니다.</li>
	<li>흉곽 위의 연조직을 제거합니다(그림 1B). 소작 펜으로 양쪽 끝의 주요 혈관을 소작합니다. 참고: 피부의 10mm 원형 절개 아래에 있는 모든 연조직을 절제하는 것 외에도 주변에서 일부 비근육 연조직을 추가로 제거하면 시술의 향후 단계가 용이합니다.</li>
	<li>한 손으로 집게를 사용하여 6번째 또는 7번째 갈비뼈를 들어 올립니다. 다른 손으로는 뭉툭한 미세 해부 가위의 단일 날(흉벽과 평행하게 기울어지고 둥근 모서리가 아래를 향함)을 사용하여 6번째 또는 7 번째늑간근 을 조심스럽게 뚫어 흉강으로 들어갑니다(그림 1C). 필요에 따라 가위를 부드럽게 돌리고 늑간 공간을 ~10mm 절개하도록 자르고 폐 조직을 만지거나 갈비뼈가 잘리지 않도록 주의합니다.</li>
	<li>늑간 절개 부위로 압축 공기를 섬세하게 배출하여 폐와 흉벽 사이의 공간을 늘립니다. 먼저 손목이나 손으로 공기를 배출하여 적절한 유동 강도를 찾고 노즐의 이물질을 제거한 다음 절개 부위에서 짧은 분사로 폐 손상을 방지합니다.</li>
	<li>한 손으로 집게를 사용하여 6번째 또는 7번째 갈비뼈를 들어 올립니다. 다른 손으로 견인기를 닫은 상태로 늑간 절개부에 삽입합니다. 견인기의 날이 흉벽과 평행이 되도록 방향을 잡고 폐 자체에 닿지 않도록 주의합니다(그림 1D).</li>
	<li>견인기가 제자리에 있으면 손잡이를 천천히 풀어 견인기가 열리고 폐가 노출되도록 합니다(그림 1E). 그림 2A 는 광시야 조명을 사용하는 동안 육안으로 보이는 모습과 FITC(녹색, 비광변환) 및 TRITC(적색, 광변환) 형광 채널에서 광변환 전에 노출된 폐 전이의 대표적인 이미지를 보여줍니다.</li>
</ol>3. 폐 전이 광변환
참고: 다음 단계에 대한 자세한 내용 및 변형은 토론에서 찾을 수 있습니다.
<ol><li>건조를 방지하기 위해 37°C로 데운 멸균 PBS 2-3방울을 노출된 폐 조직에 부드럽게 바릅니다.</li>
	<li>작은 컷아웃이 있는 멸균 알루미늄 호일 조각을 마우스 위에 놓습니다. 노출된 폐 조직 바로 위에 컷아웃을 배치하고 흉부의 열린 부분과 몇 밀리미터의 주변 연조직 및 피부만 노출되도록 크기를 조정하여 노출된 폐만 광변환되도록 합니다.</li>
	<li>마우스와 알루미늄 호일 위에 컷아웃이 있는 상자를 놓습니다. 컷아웃이 노출된 폐 바로 위에 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>광변환 램프를 상자의 컷아웃 바로 위에 놓습니다(그림 1F).</li>
	<li>광변환 램프를 켜고 노출된 폐 조직을 6분 동안 계속 비추십시오. 알림: 인공호흡기의 생리학적 모니터링 프로그램을 사용하여 마우스의 활력 징후를 모니터링합니다.</li>
	<li>광변환 후 램프를 끄고 마우스에서 램프, 상자 및 알루미늄 호일 마스크를 제거합니다.</li>
</ol>4. 흉벽 봉합 절차
<ol><li>2.13단계를 반복하여 흉벽에서 폐를 분리합니다.</li>
	<li>견인기 손잡이를 조심스럽게 잡고 꽉 쥐어 블레이드를 닫습니다.</li>
	<li>닫힌 견인기를 늑간 공간 밖으로 밀어내고 폐 조직을 만지지 않도록 주의합니다.</li>
	<li>5-0 실크 봉합사를 사용하여 절개 부위 양쪽에 갈비뼈를 통합하는 간단한 연속 봉합사 패턴으로 늑간 절개 부위를 봉합합니다(그림 1G). 봉합사를 단단히 당겨 상처 가장자리가 정립되도록 하고 흉벽의 무결성을 다시 설정합니다(그림 1H). 늑간 근육이 찢어질 수 있으므로 봉합사를 과도하게 조이지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>봉합사의 양쪽 끝을 4번 매듭을 지어 봉합사를 고정합니다. 봉합사 꼬리를 가능한 한 매듭에 가깝게 자릅니다.</li>
	<li>수술용 스테이플로 피부를 닫으십시오.</li>
	<li>28G 바늘이 부착된 1mL 인슐린 주사기로 흉강에서 과도한 공기를 제거합니다. 시포이드 돌기를 촉각적으로 찾고 바늘을 바로 아래에 삽입하고 왼쪽 어깨 쪽으로 전진하여 횡격막을 통해 흉강으로 들어갑니다. 주사기를 ~1mL로 다시 뺍니다. 마우스에서 바늘을 제거하고 주사기에서 공기를 배출합니다. 이 과정을 3-4회 반복합니다. 알림: 내부 장기에 구멍이 뚫리지 않도록 주의하십시오. 또한 더 큰 부피의 주사기를 사용하여 한 번에 모든 공기를 제거하려고 하는 것보다 1mL 주사기를 사용하고 절차를 3-4회 반복하는 것이 중요합니다. 더 큰 부피의 주사기를 사용하면 흉강의 진공이 너무 커져 폐 조직이 팽창하고 손상될 수 있습니다.</li>
	<li>이소플루란을 끕니다.</li>
	<li>쥐가 깨어날 기미가 보일 때까지 100% 산소로 환기를 계속하십시오.</li>
	<li>쥐가 깨어날 기미가 보이면 인공호흡기에서 삽관 카테터를 분리하고 주변의 봉합사를 자른 다음 쥐를 발관합니다.</li>
	<li>마우스의 테이프를 풀고 열 램프 아래 ~2피트에 위치한 깨끗한 케이지로 옮깁니다. 완전히 회복될 때까지 모니터링하십시오. 쥐가 호흡 곤란이나 움직임 부족의 징후를 보이면 5% 이소플루란으로 5분 동안 마취하고, 발가락을 꼬집을 때 반사 신경이 사라지는 것을 관찰하여 적절한 마취를 보장하고, 자궁 경부 탈구를 통해 안락사시킵니다.</li>
	<li>쥐가 마취에서 완전히 깨어나 움직이기 시작하면 부프레노르핀 0.1mg/kg을 추가로 준비하고 수술 후 진통을 위해 피하 주사합니다.</li>
	<li>수술 후에는 쥐가 개별적으로 수용되었는지 확인하십시오. 식수에 항생제(엔로플록사신, 최종 농도 0.4mg/mL)를 제공합니다.</li>
	<li>수술 후 3일 동안은 하루에 두 번 마우스에 통증의 징후가 있는지 확인하십시오. 통증 관리를 위해 4-6시간마다 0.1mg/kg 부프레노르핀(0.03mg/mL)을 피하 투여합니다. 쥐가 감염, 부동성 또는 호흡 곤란의 징후를 보이면 안락사시킵니다. 3일째 이후에는 하루에 한 번 마우스를 확인할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 시료 처리 및 조직 투명화를 이용한 광변환 세포 검출
<ol><li>광전환 수술 후 3 내지 5일(또는 원하는 기간) 사이에, 마우스를 5% 이소플루란으로 마취하고, 유도 후 이소플루란을 5%에서 2.5%로 감소시키고, 발가락 꼬집음 시 반사의 손실을 관찰하여 적절한 마취를 보장하고, 10mL의 실온 PBS로 말단 심경 관류를 수행한 후, 앞서 설명한 바와 같이 4% 파라포름알데히드 10mL를 4°C로 냉각시킨다31.</li>
	<li>관심 장기를 수집하고 앞서 설명한 대로 광학적으로 투명하게 합니다31.</li>
	<li>앞서 설명한 대로 광시트 현미경으로 투명화된 조직을 이미지화합니다31. 또는 투명화된 조직을 유리 바닥 접시에 넣고 FITC 및 TRITC 채널의 이미지를 배치하여 컨포칼, 회전 디스크 또는 다광자 현미경을 사용하여 녹색(비광변환) 및 적색(광변환) 세포를 시각화합니다.</li>
</ol>6. 시료 처리 및 조직 분해를 이용한 광변환 세포 검출
<ol><li>5분 동안 5% 이소플루란으로 마우스를 마취하고, 발가락 꼬집음 시 반사 손실을 관찰하여 적절한 마취를 보장하고, 광변환 후 3-5일 후에 자궁 경부 탈구를 통해 희생합니다.</li>
	<li>앞서 설명한 대로 관심 기관을 수집하고 소화합니다13.</li>
	<li>소화된 조직을 도금하고 인큐베이터에 넣어 앞서 설명한 대로 하룻밤 동안 부착합니다13.</li>
	<li>다음 날, FITC 및 TRITC 채널에서 도금된 세포를 이미지화하여 앞서 설명한 대로 녹색(비광변환) 및 적색(광변환) 세포를 시각화합니다13.</li>
</ol>

폐 전이로부터의 종양 세포 전파 검사

<ol>
	<li>Dillek&#229;s, H., Rogers, M. S., Straume, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+90%+of+deaths+from+cancer+caused+by+metastases.">Are 90% of deaths from cancer caused by metastases.</a> Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).</li><li>Gupta, G. P., Massagu&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+building+a+framework.">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li><li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagu&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis:+from+dissemination+to+organ-specific+colonization.">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nature Reviews. 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(159), (2020).</li><li>Das, S., MacDonald, K., Sucie Chang, h. -. y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+mouse+lung+intubation.">A simple method of mouse lung intubation.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).</li><li>DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+mouse+lung+cancer+models+using+adenoviral+or+lentiviral+delivery+of+Cre+recombinase.">Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase.</a> Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).</li><li>Hsu, C. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EZ+Clear+for+simple,+rapid,+and+robust+mouse+whole+organ+clearing.">EZ Clear for simple, rapid, and robust mouse whole organ clearing.</a> eLife. 11, e77419 (2022).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setup+and+use+of+a+two-laser+multiphoton+microscope+for+multichannel+intravital+fluorescence+imaging.">Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).</li><li>Gambotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+enhanced+green+fluorescent+protein+(EGFP)+in+BALB/c+mice:+identification+of+an+H2-Kd-restricted+CTL+epitope.">Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope.</a> Gene Therapy. 7 (23), 2036-2040 (2000).</li><li>Han, W. G. H., Unger, W. W. J., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+immunodominant+CTL+epitope+of+EGFP+in+C57BL/6+mice.">Identification of the immunodominant CTL epitope of EGFP in C57BL/6 mice.</a> Gene Therapy. 15 (9), 700-701 (2008).</li><li>Stripecke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+to+green+fluorescent+protein:+implications+for+gene+therapy.">Immune response to green fluorescent protein: implications for gene therapy.</a> Gene Therapy. 6 (7), 1305-1312 (1999).</li><li>Rosenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cytotoxic+T+lymphocyte+and+antibody+responses+to+enhanced+green+fluorescent+protein+following+transplantation+of+transduced+CD34(+)+hematopoietic+cells.">Induction of cytotoxic T lymphocyte and antibody responses to enhanced green fluorescent protein following transplantation of transduced CD34(+) hematopoietic cells.</a> Blood. 97 (7), 1951-1959 (2001).</li><li>Grzelak, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+fluorescent+protein+immunogenicity+permits+modeling+of+metastasis+in+immune-competent+settings.">Elimination of fluorescent protein immunogenicity permits modeling of metastasis in immune-competent settings.</a> Cancer Cell. 40 (1), 1-2 (2022).</li><li>Fluegen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+of+disseminated+tumour+cells+is+preset+by+primary+tumour+hypoxic+microenvironments.">Phenotypic heterogeneity of disseminated tumour cells is preset by primary tumour hypoxic microenvironments.</a> Nature Cell Biology. 19 (2), 120-132 (2017).</li><li>Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+engrafted+human+cancer+and+therapy+responses+in+immunodeficient+zebrafish.">Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish.</a> Cell. 177 (7), 1903.e14-1914.e14 (2019).</li><li>Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+permanent+window+for+investigating+cancer+metastasis+to+the+lung.">A permanent window for investigating cancer metastasis to the lung.</a> Journal of Visualized Experiments. (173), (2021).</li><li>Tohme, S., Simmons, R. L., Tsung, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery+for+cancer:+a+trigger+for+metastases.">Surgery for cancer: a trigger for metastases.</a> Cancer Research. 77 (7), 1548-1552 (2017).</li><li>Al-Sahaf, O., Wang, J. H., Browne, T. J., Cotter, T. G., Redmond, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+injury+enhances+the+expression+of+genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+lung.">Surgical injury enhances the expression of genes that mediate breast cancer metastasis to the lung.</a> Annals of Surgery. 252 (6), 1037-1043 (2010).</li><li>Lu, N., Piao, M. -. H., Feng, C. -. S., Yuan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+promotes+epithelial-to-mesenchymal+transition+and+metastasis+of+bladder+cancer+cells+through+HIF-1&#945;-&#946;-catenin/Notch1+pathways.">Isoflurane promotes epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer cells through HIF-1&#945;-&#946;-catenin/Notch1 pathways.</a> Life Sciences. 258, 118154 (2020).</li><li>Jiao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+volatile+anesthetics+and+tumor+progression:+unveiling+the+mystery.">Relationship between volatile anesthetics and tumor progression: unveiling the mystery.</a> Current Medical Science. 38 (6), 962-967 (2018).</li></ol>

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

이 논문에서는 폐에서 종양 세포의 선택적 광변환을 위한 수술 프로토콜을 설명합니다. 이 기술을 통해 연구자들은 폐의 종양 세포를 선택적으로 표시하고 나중에 전신에서 종양 세포를 재식별하여 폐 전이에서 전이 연구를 용이하게 함으로써 그 운명을 추적할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 광변환 수술을 받은 마우스의 뇌, 간 및 광변환되지 않은 오른쪽 폐에서 광전환 세포를 시각화할...

전이는 암 관련 사망의 주요 원인이다1. 전이성 암은 원발성 종양의 세포가 몸 전체로 퍼져 멀리 떨어진 장기에서 임상적으로 검출 가능한 종양으로 증식할 때 발생한다 2,3.
전이는 일반적으로 종양 세포가 원발성 종양에서 퍼져 멀리 떨어진장기를 식민지화하는 단방향 과정으로 생각되지만4 임상 및 실험적 증거가 증가함에 따라 더 복잡하고 다방향적인 과정이 작용하고 있음을 시사한다. 순환 종양 세포는 원발성 종양(아직 제자리에 있는 경우)을 재파종할 수 있으며5,6,7,8,9 기존 전이성 병소의 종양 세포는 3차 부위로 이동하여 새로운 병변을 일으킬 수 있는 것으로 나타났다 10,11,12,13. 실제로, 최근 게놈 분석의 증거에 따르면 일부 전이성 병변은 원발성 종양이 아니라 다른 전이에서 발생하며, 이러한 현상은 "전이에서 전이" 또는 "전이에서 전이로의 파종"으로 알려져 있습니다14,15,16. 전이-전이 파종은 원발성 종양을 제거한 후에도 질병 진행을 지속시켜 전이성 부담을 증가시키고 환자의 삶의 질과 생존율을 떨어뜨릴 수 있습니다. 따라서 전이에서 전이로의 파종 과정을 이해하는 것은 전이성 질환 환자의 치료 전략을 개선하는 데 매우 중요합니다.
잠재적으로 심각한 임상적 영향에도 불구하고, 부분적으로 물류 및 기술적 한계로 인해 전이-전이 파종에 대해 알려진 바가 거의 없습니다. 사람을 대상으로 한 연구는 임상 샘플의 부족으로 인해 한계가 있습니다. 전이성 병변의 임상적 절제와 생검은 드물며, 겉보기에 건강해 보이는 장기의 생검도 드물며, 단일 파종된 종양 세포가 숨어 있을 수 있습니다. 즉, 인간 대상 연구는 일반적으로 원발성 종양이 아직 제자리에 있거나 이전에 절제되었지만 연구자가 여전히 사용할 수 있는 개인의 부검 샘플을 사용해서만 가능합니다. 이러한 샘플을 이용할 수 있는 경우, 암 진행에 대한 계통 분석은 염기서열 분석 방법14을 사용하여 수행되어야 한다. 그러나 일치하는 원발성 종양 및 전이의 대량 염기서열 분석은 포괄적인 계통 추적에 필요한 민감도를 가지고 있지 않습니다. 예를 들어, 하나의 병변에 대한 대량 염기서열 분석은 일치하는 병변 중 어느 것에서도 검출할 수 없는 서브클론을 드러낼 수 있습니다. 이 경우 이 서브클론의 기원을 확인할 수 없습니다. 원발성 종양 또는 다른 전이에서 검출 한계 이하의 빈도로 존재했을 수도 있고, 발견된 전이성 병변의 초기 집락화 이후에 발생했을 수도 있습니다. 단일 세포 염기서열분석은 향상된 감도를 제공하지만 높은 비용으로 인해 이 기술의 대규모 적용이 제한됩니다. 이러한 연구의 후향적 특성은 또한 일시적인 전이성 사건과 서로 다른 시점의 질병 환경에 대한 제한된 통찰력을 제공한다는 것을 의미합니다.
동물 모델에서, 최근의 기술 발전은 이제 높은 공간 및 시간 해상도 17,18,19,20을 갖는 전향적 계통발생 매핑을 가능하게 한다. 이러한 기술은 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 활용하여 시간이 지남에 따라 축적되는 유전 가능한 돌연변이인 진화하는 바코드로 세포를 엔지니어링합니다. 염기서열분석 시 각 세포의 계통은 바코드 17,18,19,20의 돌연변이 프로파일을 기반으로 추적할 수 있습니다. 실제로, 이러한 기술은 이미 전이-전이 파종을 매핑하는 데 사용되고 있습니다. 최근 논문에서 Zhang 등은 뼈 전이의 유방암 및 전립선암 세포가 뼈에서 재확산되어 여러 장기의 2차 전이를 종자한다는 것을 입증했습니다21.
이러한 새로운 방법은 암 진행에 대한 상세한 고해상도 계통발생 지도를 생성할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있지만, 전이에서 전이로의 파종 사건의 정확한 시기와 이를 촉진하거나 예방하는 요인을 연구하는 사람들에게는 매우 비실용적입니다. 이러한 지식 격차를 해소하는 것은 전이성 암에 대한 이해와 치료를 개선하는 데 매우 중요하지만 이러한 연구를 촉진하는 기술이 눈에 띄게 부족합니다. 이러한 요구를 해결하기 위해 우리는 최근에 전이 부위(폐)에서 광변환을 통해 종양 세포를 특이적으로 표시한 후 3차 장기에서 재식별할 수 있는 새로운 기술을 개발하여 여기에 제시합니다. 이 기술을 사용하여 우리는 최근 유방암 세포가 폐 전이와 종자 3차 장기에서 재증식한다는 것을 보여주었다13. 이 기술은 또한 좁은 창 내에서 재확산 사건의 타이밍을 결정하고 재확산된 종양 세포를 정량화하는 데 사용할 수 있으며, 재확산된 세포의 유기 영양성 및 재확산을 촉진/방지하는 요인에 대한 연구를 용이하게 합니다.
하나의 형광 단백질을 다른 형광 단백질로 영구적으로 대체하는 광변환 및 국소 유도 cre/lox 시스템은종양 세포를 표시하고 추적하는 데 이전에 사용되었지만, 우리가 아는 한, 종양 세포의 시공간 표시에 대한 접근 방식은 가장 흔한 14가지 암 중 하나로 진단된 남성과 여성에게 가장 흔한 전이 부위 중 하나인 폐를 표적으로 삼도록 최적화되지 않았습니다24. 모든 암세포 유형과 폐 전이 생성을 위한 모든 프로토콜을 당사 절차와 함께 사용할 수 있으므로 전이 연구자에게 광범위하게 유용합니다. 폐 전이를 생성하는 데 사용되는 모든 암세포는 광전환 또는 광전환 가능한 단백질을 발현해야 하며, 연구자들은 특정 필요와 자원에 따라 사용할 단백질을 선택할 수 있습니다. 이 연구에서는 히스톤 H2B에 태그된 광변환 가능한 녹색-적색 형광 단백질 Dendra2(6DT1-Dendra2 세포)25를 안정적으로 발현하는 6DT1 유방암 세포를 사용했습니다. 5.0 × 104 6DT1-Dendra2 세포를 암컷 Rag2-/- 마우스의 네 번째 유방 지방 패드에 주입했습니다. 원발성 종양은 주사 후 12일에서 16일 사이에 만져질 수 있었고 실험 기간 동안 절제되지 않았습니다. 자발적 폐 전이는 종양 세포 주입 후 19일에서 26일 사이에 발생했습니다. 광전환 수술은 종양 세포 주입 후 26일에서 29일 사이에 수행되었습니다. 마우스는 폐 전이 부담으로 인해 수술 후 72시간 이내에 희생되었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0-30 V, 0-3 A Power Supply</td>
			<td>MPJA</td>
			<td>9616 PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply</td>
			<td>MPJA</td>
			<td>17563 PD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 G 1 mL BD Insulin Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 nm light emitting diode array lamp</td>
			<td>LedEngin Inc.</td>
			<td>897-LZPD0UA00</td>
			<td>Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle</td>
			<td>Ethicon, Inc.</td>
			<td>774B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 cm 2-0 silk tie</td>
			<td>Ethicon, Inc.</td>
			<td>LA55G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril 100 (enrofloxacin)</td>
			<td>Bayer (Santa Cruz Biotechnology)</td>
			<td>sc-362890Rx</td>
			<td>Antibiotic used in drinking water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>0409-2012-32</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cables (Cable Assemblies) 2.1 DC JACK-STRAIGHT 72&#34;&#160; BLACK/ZIP CORD</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>172-7426-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72&#34; ZIP CD</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>172-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine solution</td>
			<td>Durvet</td>
			<td>7-45801-10258-3</td>
			<td>Chlorhexidine Disinfectant Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air canister</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>DPSJB-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4&#34; Straight Sharp/Sharp 24 mm</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5912</td>
			<td>Sharp Micro Dissecting Scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-optic illuminator</td>
			<td>O.C. White Company</td>
			<td>FL3000</td>
			<td>Used during mouse intubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemini Cautery Kit</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>726067</td>
			<td>Cautery pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germinator 500</td>
			<td>CellPoint Scientific</td>
			<td>GER&#160;5287-120V</td>
			<td>Bead Sterilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High power LEDs - single color ultraviolet 90 watts</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>LZP-D0UA00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared heat lamp</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>HL-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane SOL 250 mL PVL</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>29405</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer</td>
			<td>SurgiVet</td>
			<td>VCT302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jacobson needle holder with lock</td>
			<td>Kalson Surgical</td>
			<td>T1-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S68702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR &#38; LOC PIN</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>928-C11395TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long cotton tip applicators</td>
			<td>Medline Industries</td>
			<td>MDS202055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan</td>
			<td>CompUSA</td>
			<td>#S457-1023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Scissors 4&#34; Straight Blunt/Blunt</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5980</td>
			<td>Blunt Micro Dissecting Scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine ventilator</td>
			<td>Kent Scientific&#160;</td>
			<td>PS-02</td>
			<td>PhysioSuite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair Hair Removal Lotion</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B001RVMR7K</td>
			<td>Depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personnet mini retractor</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6504</td>
			<td>Retractor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline 1x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>51005</td>
			<td>Dendra2 lentivirus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>008897</td>
			<td>Eye Lubricant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent intubation stand</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>RIS 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal lung inflation bulb</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-9083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SURGI-M02</td>
			<td>Heated surgical platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Leads 48&#34; TEST LEAD BANANA - Black</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>565-1440-48-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Leads 48&#34; TEST LEAD BANANA - Red</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>565-1440-48-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tracheal catheter&#160;</td>
			<td>Exelint International</td>
			<td>26746</td>
			<td>22 G catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound closing system veterinary kit</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>IN015</td>
			<td>Veterinary surgical stapling kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking tumor cell dissemination from lung metastases using photoconversion

암의 전신 확산인 전이는 암 관련 사망의 주요 원인입니다. 전이는 일반적으로 원발성 종양의 세포가 퍼져나가 종자 전이가 되는 단방향 과정으로 생각되지만, 기존 전이의 종양 세포도 "전이에서 전이" 또는 "전이에서 전이로의 파종"으로 알려진 과정을 통해 3차 부위에 새로운병변을 일으키고 재파종할 수 있습니다. 전이-전이 파종은 전이 부담을 증가시키고 환자의 삶의 질과 생존율을 떨어뜨릴 수 있습니다. 따라서 이 현상의 이면에 있는 과정을 이해하는 것은 전이성 암 환자의 치료 전략을 개선하는 데 매우 중요합니다.
전이에서 전이로의 파종에 대해서는 알려진 바가 거의 없는데, 이는 부분적으로 물류 및 기술적 한계 때문입니다. 전이-전이 파종에 대한 연구는 주로 염기서열 분석 방법에 의존하는데, 이는 전이-전이 파종 사건의 정확한 시기나 이를 촉진하거나 예방하는 요인을 연구하는 연구자에게는 실용적이지 않을 수 있습니다. 이는 전이-전이 파종 연구를 촉진하는 방법론이 부족하다는 것을 강조합니다. 이 문제를 해결하기 위해 폐 전이의 선택적 광전환을 위한 쥐 수술 프로토콜을 개발하여 폐에서 3차 부위로 재분해하는 종양 세포의 특이적 표시 및 운명 추적을 가능하게 합니다. 우리가 아는 한, 이것은 게놈 분석이 필요하지 않은 폐에서 종양 세포 재확산 및 전이-전이 파종을 연구하는 유일한 방법입니다.

Metastasis is the leading cause of cancer-related deaths1.&#160;Metastatic cancer arises when cells from the primary tumor disseminate throughout the body and proliferate into clinically detectable tumors in distant organs2,3.
Although metastasis is commonly thought of as a unidirectional process wherein tumor cells disseminate from the primary tumor and colonize distant organs4, increasing clinical and experimental evidence suggests that a more complex, multi-directional process is at play. It has been shown that circulating tumor cells can reseed the primary tumor (if still in place)5,6,7,8,9, and tumor cells from existing metastatic foci can travel to tertiary sites and give rise to new lesions10,11,12,13. Indeed, evidence from recent genomic analyses suggests that some metastatic lesions arise not from the primary tumor, but from other metastases-a phenomenon known as &#34;metastasis-from-metastases&#34; or &#34;metastasis-to-metastasis seeding&#34;14,15,16. Metastasis-to-metastasis seeding can perpetuate the disease process even after removal of the primary tumor, increasing metastatic burden, and decreasing patient quality of life and survival. Therefore, understanding the processes behind metastasis-to-metastasis seeding is crucial to refining treatment strategies for patients with metastatic disease.
Despite the potentially severe clinical implications, little is known about metastasis-to-metastasis seeding, due in part to logistical and technological limitations. Human studies are limited by a paucity of clinical samples. Clinical resection and biopsy of metastatic lesions are uncommon, as is the biopsy of seemingly healthy organs, where single disseminated tumor cells may lurk. This means that human studies are typically only possible using autopsy samples from individuals whose primary tumors are either still in place or were previously resected but are still available to researchers. When such samples are available, lineage analyses of cancer progression must be performed using sequencing methods14. However, bulk sequencing of matched primary tumors and metastases does not have the sensitivity needed for comprehensive lineage tracing. For instance, bulk sequencing of one lesion may reveal a subclone that is undetectable in any of its matched lesions. In this case, one would be unable to determine the origin of this subclone. It may have been present in the primary tumor or another metastasis at a frequency below the limit of detection, or it may have arisen after the initial colonization of the metastatic lesion it was found in. Single-cell sequencing provides increased sensitivity, but its high cost limits the large-scale application of this technique. The retrospective nature of these studies also means that they provide limited insight into transient metastatic events and the disease landscape at different time points.
In animal models, recent technological advances now allow for prospective phylogenetic mapping with high spatial and temporal resolution17,18,19,20. These techniques utilize CRISPR/Cas9 genome editing to engineer cells with an evolving barcode - heritable mutations that accumulate over time. Upon sequencing, the lineage of each cell can be traced based on the mutational profile of its barcode17,18,19,20. Indeed, such technology is already being used to map metastasis-to-metastasis seeding. In a recent paper, Zhang et al. demonstrated that breast and prostate cancer cells in bone metastases redisseminate from the bone to seed secondary metastases in multiple organs21.
While these novel methods have great potential to generate detailed, high-resolution phylogenetic maps of cancer progression, they are highly impractical for those studying the exact timing of metastasis-to-metastasis seeding events and what promotes or prevents them. Filling these knowledge gaps is crucial to refining our understanding and treatment of metastatic cancer, but there is a noticeable lack of technologies to facilitate such studies. To address this need, we recently developed - and present herein - a novel technique that allows us to specifically mark tumor cells via photoconversion in a metastatic site (the lung) and subsequently reidentify them in tertiary organs. Using this technique, we recently showed that breast cancer cells do redisseminate from lung metastases and seed tertiary organs13. This technique may also be used to determine the timing of redissemination events within a narrow window and quantify redisseminated tumor cells, facilitating the study of organotropism of redisseminated cells and what promotes/prevents redissemination.
While photoconversion and locally inducible cre/lox systems that permanently replace one fluorescent protein with another have been previously used to mark and track tumor cells11,22,23, to our knowledge, no approach for spatiotemporal marking of tumor cells has been optimized to target the lung - one of the most common sites of metastasis among men and women diagnosed with any of the 14 most common cancers24. Any cancer cell type and any protocol for lung metastasis generation may be used with our procedure, making it broadly useful for metastasis researchers. All cancer cells used to generate lung metastases should express a photoconvertible or photo-switchable protein, and researchers may choose which protein to use based on their specific needs and resources. In this study, we used 6DT1 breast cancer cells that stably expressed the photoconvertible green-to-red fluorescent protein Dendra2 (6DT1-Dendra2 cells)25 tagged to the histone H2B. We injected 5.0 &#215; 104 6DT1-Dendra2 cells into the fourth mammary fat pad of female Rag2-/- mice. Primary tumors were palpable between 12 and 16 days after injection and were not resected for the duration of the experiment. Spontaneous lung metastases developed between 19 and 26 days after tumor cell injection. Photoconversion surgeries were performed between 26 and 29 days after tumor cell injection. Mice were sacrificed by 72 h post surgery due to lung metastasis burden.

저자 스포트라이트: 유방암 전이를 추적하기 위한 새로운 생체 내 기법을 사용하여 전이에서 전이로의 시딩 해독 

광변환을 사용한 폐 전이에서 종양 세포 전파 추적

Recent evidence suggests that existing metastatic lesions can act as a source of disseminating tumor cells that give rise to new lesions. This process is called metastasis to metastasis seeding and can increase tumor burden and decrease the quality of life and survival of cancer patients. Our method was developed to study metastasis to metastasis seeding and the factors that influence it.This technique has helped our lab establish that breast cancer cells can spread from lung metastases and enabled us to investigate factors that promote or prevent metastasis. These findings may guide future research on slowing the progression of metastatic cancer. The lungs are a common site of metastasis, but very few techniques allow for the study of tumor cell dynamics in vivo.This technique enables the tracking of tumor cells in live mice facilitating the study of lung metastasis specific dissemination pathways and therapies. Metastatic cancer is often an incurable and fatal disease. This technique can be used to study ways to reduce its spread leading to therapies that extend the lives of patients.

이 프로토콜에 설명된 수술 단계는 그림 1에 나와 있습니다. 간단히 말해서 쥐를 마취하고 왼쪽 흉부에서 머리카락을 제거합니다. 그런 다음 마우스를 삽관하고 환기시켜 흉강이 열려 있는 동안 마우스가 산소를 공급받을 수 있도록 합니다. 흉곽을 노출시키기 위해 연조직을 제거하고 6번째 또는 7번째 늑간근을 절개합니다. 늑간 틈새에 견인기를 삽입하고 ?...

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폐 전이의 선택적 광전환을 위한 수술 프로토콜과 함께 폐 전이에서 종양 세포 재확산을 연구한 후 3차 장기에서 재분해된 종양 세포를 식별하는 방법을 제시합니다.

Metastasis - the systemic spread of cancer - is the leading cause of cancer-related deaths. Although metastasis is commonly thought of as a unidirectional ...

최근의 증거에 따르면 기존의 전이성 병변은 새로운 병변을 유발하는 종양 세포를 퍼뜨리는 원천으로 작용할 수 있습니다. 이 과정을 전이에서 전이로의 파종이라고 하며, 종양 부담을 증가시키고 암 환자의 삶의 질과 생존율을 떨어뜨릴 수 있습니다. 우리의 방법은 전이에서 전이 시드와 이에 영향을 미치는 요인을 연구하기 위해 개발되었습니다.이 기술은 우리 연구실에서 유방암 세포가 폐 전이에서 퍼질 수 있음을 확립하는 데 도움이 되었으며 전이를 촉진하거나 예방하는 요인을 조사할 수 있었습니다. 이러한 발견은 전이성 암의 진행을 늦추는 것에 대한 향후 연구의 지침이 될 수 있습니다. 폐는 흔한 전이 부위이지만, 생체 내에서 종양 세포 역학을 연구할 수 있는 기술은 거의 없습니다.이 기술을 사용하면 살아있는 쥐의 종양 세포를 추적할 수 있어 폐 전이 특이적 전파 경로 및 치료법에 대한 연구를 용이하게 할 수 있습니다. 전이성 암은 종종 불치의 치명적인 질병입니다. 이 기술은 환자의 생명을 연장하는 치료법으로 이어지는 확산을 줄이는 방법을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Tracking Tumor Cell Dissemination from Lung Metastases Using Photoconversion

822 조회수.  Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center. 최근의 증거에 따르면 기존의 전이성 병변은 새로운 병변을 유발하는 종양 세포를 퍼뜨리는 원천으로 작용할 수 있습니다. 이 과정을 전이에서 전이로의 파종이라고 하며, 종양 부담을 증가시키고 암 환자의 삶의 질과 생존율을 떨어뜨릴 수 있습니다. 우리의 방법은 전이에서 전이 시드와 이에 영향을 미치는 요인을 연구하기 위해 개발되었습니다.이 기술은 우리 연구?...

비디오: 저자 스포트라이트: 유방암 전이를 추적하기 위한 새로운 생체 내 기법을 사용하여 전이에서 전이로의 시딩 해독 

Metastasis - the systemic spread of cancer - is the leading cause of cancer-related deaths. Although metastasis is commonly thought of as a unidirectional process wherein cells from the primary tumor disseminate and seed metastases, tumor cells in existing metastases can also redisseminate and give rise to new lesions in tertiary sites in a process known as &#34;metastasis-from-metastases&#34; or &#34;metastasis-to-metastasis seeding.&#34; Metastasis-to-metastasis seeding may increase the metastatic burden and decrease the patient&#39;s quality of life and survival. Therefore, understanding the processes behind this phenomenon is crucial to refining treatment strategies for patients with metastatic cancer.
Little is known about metastasis-to-metastasis seeding, due in part to logistical and technological limitations. Studies on metastasis-to-metastasis seeding rely primarily on sequencing methods, which may not be practical for researchers studying the exact timing of metastasis-to-metastasis seeding events or what promotes or prevents them. This highlights the lack of methodologies that facilitate the study of metastasis-to-metastasis seeding. To address this, we have developed - and describe herein - a murine surgical protocol for the selective photoconversion of lung metastases, allowing specific marking and fate tracking of tumor cells redisseminating from the lung to tertiary sites. To our knowledge, this is the only method for studying tumor cell redissemination and metastasis-to-metastasis seeding from the lungs that does not require genomic analysis.

We present a method for studying tumor cell redissemination from lung metastases involving a surgical protocol for the selective photoconversion of lung metastases, followed by the identification of redisseminated tumor cells in tertiary organs.

연구

암 연구학

Surgical Protocol for the Selective Photoconversion of Lung Metastases

After preparing the mouse for surgery, identify the target area, seven millimeters to the left of the sternum and about seven millimeters above the subcostal margin. Lift the skin over the identified area using forceps and make a 10 millimeter circular incision using sharp micro dissecting scissors to cut only the skin. Then remove the soft tissue over the rib cage and cauterize any major blood vessels at both ends using a cautery pen.Elevate the sixth or seventh rib with forceps and use a single blade of the blunt micro dissecting scissors to pierce the intercostal muscle. Now gently rotate the scissors and make an approximately 10 millimeter incision in the intercostal space while avoiding contact with the lung tissue and the ribs. Release compressed air at the wrist or hand delicately to determine the suitable flow strength and clear the nozzle of debris.Then apply short bursts of air at the incision to avoid causing lung injury. With the forceps, lift the sixth or seventh rib and insert the retractor into the intercostal incision with blades parallel to the chest wall. Then release the handle carefully to let the retractor open and reveal the lung gradually.Now apply two to three drops of sterile PBS warmed to 37 degrees onto the exposed lung tissue to prevent it from drying. Overlay a piece of aluminum foil with a small cutout over the mouse, positioning it directly over the exposed lung tissue. Ensure the cutout only shows the open thorax and the nearby tissue for targeted lung photo conversion.Next position a box with a cutout over the mouse and aluminum foil, ensuring the cutout aligns with the exposed lung. And set the photo conversion lamp directly above the cutout on the box. Then activate the photo conversion lamp to illuminate the exposed lung tissue for a continuous span of six minutes.After the photo conversion, deactivate the lamp and clear the lamp box and aluminum foil mask away from the mouse. Separate the lung from the chest wall by discharging air at the wrist, and then discharge air at the chest incision. Firmly grasp the retractor handle and squeeze it to close the blades.Carefully maneuver the closed retractor out of the intercostal space, ensuring not to contact the lung tissue. Then use the 5-0 silk suture to close the intercostal incision with a simple continuous suture pattern, ensuring that the rib on both sides of the incision is incorporated. Pull the suture firmly to ensure the wound edges align, re-establishing the chest wall's integrity.Secure the suture by knotting the end four times. Trim the suture tails as close to the knot as possible, and close the skin using surgical staples. To remove excess air from the thoracic cavity, insert a one milliliter syringe with a 28 gauge needle below the xiphoid process.Draw the syringe back to approximately one milliliter. Remove the syringe from the mouse and discharge the air. Images of exposed Dendra2 expressing lung metastases prior to blue light exposure are shown.Exposing Dendra2 expressing lung metastases to blue light showed that six minute exposure produced the brightest signal in the photo converted channel in both ex vivo and in vivo samples. Photo converted and non-photo converted cells were identified in all three tissue types from mice that underwent surgery with blue light exposure. Only non-photo converted tumor cells were found in the tissues of mice that underwent surgery without blue light exposure.