이 방법은 E.Coli에서 표현하기 어려운 유전자 제품이 어떻게 정화되는지와 같은 미생물학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 PCR 이외의 효소 반응이 없는 담체이며 단백질 정화를 위한 일반적인 응용을 사용할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 연쇄상 구균 뮤탄의 단백질 정제에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그것은 또한 다른 미생물 종에 감사 될 수있다.
이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 졸업생인 야마시타 마사미코 박사가 될 것입니다. 프리머 설계 및 연쇄상 구균 뮤탄에서 유전체 DNA 추출 후, 야생 형 연쇄상 구균 뮤탄및 GFC는 PCR 템플릿으로 연쇄상 구균 뮤탄게놈을 방해하여 첫 번째 PCR을 수행합니다. gtfC 유전자의 하류 부분을 수용하는 지역과 준비된 gtfC-forward 및 역 프라이머 및 spc r-forward 및 역 프라이머를 사용하여 스펙티노마이신 저항 유전자를 수용하는 영역을 증폭시한다.
이어서, 각 PCR 제품은 1%아가로즈 젤에. 젤 밴드커터를 사용하여 젤에서 약 1, 000개의 베이스 쌍및 2, 000개의 베이스 쌍을 마이크로센트심분리기 튜브로 소비합니다. 각 튜브에 용광화 버퍼 500 마이크로리터를 추가하고 젤 슬라이스를 용해시키기 위해 섭씨 56도에서 10 분 동안 배양하십시오.
실리카 멤브레인 기반 젤 추출 방법을 사용하여 조각을 정화합니다. 중첩 된 방향 및 중첩 된 역 프라이머가있는 첫 번째 PCR 의 제품을 PCR 템플릿으로 사용하여 두 번째 PCR을 수행합니다. 전기 전도에 의해 두 번째 PCR 제품을 확인할 수 없는 경우 중첩 된 프라이머의 쌍을 설계해야합니다.
아가로즈 젤상PCR 혼합물의 5개의 마이크로리터. 에디듐 브로마이드 겔 염색 영상에 의해 약 3, 000염기 쌍의 적절한 앰플리톤의 생성을 확인하고 원고에 따라 진행한다. 지금, 이전에 냉동 얼음 감기, 유능한 야생 형 연쇄상 구균 뮤탄 세포의 50 마이크로 리터 알로쿼트에 농축 된 제 2 PCR 제품의 5 마이크로 리터를 혼합.
혼합물을 전기 기공 큐벳에 넣고 큐벳을 전기 기공 장치의 큐벳 챔버에 놓습니다. 세포에 2.5 밀리초 동안 1.8 킬로볼트, 600 옴 및 10 마이크로패라드의 단일 전기 펄스를 제공합니다. 500 마이크로리터의 뇌 심장 주입 국물을 큐벳에 넣습니다.
즉시 10~100마이크로리터의 서스펜션을 스펙트럼마이신을 함유한 뇌심장 주입 오거 플레이트에 즉시 퍼집니다. 식민지가 충분히 성장 할 때까지 섭씨 37도에서 2 ~ 6 일 동안 접시를 배양하십시오. 원고에 따르면 연쇄상 구균 뮤탄의 생성 후 폴리히스티딘 코딩 서열은 4섭씨에서 10, 000배에서 20분 동안 세균 배양 현탁액을 원심분리하여 스펙티노마이신없이 변형및 야간 접종을 통합하였다.
문화 상체를 3리터 유리 비커로 옮기습니다. 배양상에서 단백질을 농축하려면 2리터 상체를 자기 교반기위에 놓고 격렬한 교반을 시작합니다. 1, 122 그램의 황산암모늄을 추가하고 침전이 4 시간 동안 또는 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 활발한 교반으로 형성되도록합니다. 다음.
심모늄 황산염 침전용액을 섭씨 4도에서 20분 동안 000배, 000배에서 원심분리합니다. 상체를 장식합니다. 주걱으로 침전물을 모아 200밀리리터 유리 비커로 옮기습니다.
결합 버퍼의 35 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 이어서, 현탁액의 약 25밀리리터를 재생셀룰로오스 투석 튜브로 옮기다. 투석 튜브를 교반 결합 버퍼의 2.5 리터에 넣고 섭씨 4도의 교반에 놓아 서스펜션을 투석합니다.
투석 용액을 2시간 후에 교체하고 밤새 투석을 계속합니다. 다음으로 투석된 서스펜션을 튜브에서 원심분리기로 옮기고, 4°C에서 10분 동안 20, 000배 의 원심분리기에 튜브를 배치합니다. 단면 여과 장비를 사용하면 0.2 마이크로미터 멤브레인 필터 위에 상체를 부어 필터링합니다.
여과물을 75밀리리터 플라스크로 옮기세요. 여과 된 서스펜션에서 폴리히스티딘 태그 gtfSI를 분수하려면 먼저 고정 금속 친화성 크로마토그래피를 준비합니다. 원고에 따라 수지를 보정한 후 호프만 핀치 수탉을 닫습니다.
필터된 서스펜션 5밀리리터를 컬럼에 추가하여 슬러리를 만듭니다. 그런 다음, 나머지 여과 된 서스펜션에 모든 슬러리를 전송하고 4 섭씨에서 30 분 동안 부드럽게 혼합물을 소용돌이. 혼합물을 다시 열에 로드합니다.
호프만 핀치 수탉을 열어 중력 흐름에 의해 서스펜션을 제거합니다. IMAC 수지와 결합 버퍼 20 밀리리터를 세척한 다음, 용출 버퍼의 20 밀리리터를 재조합 gtfSI를 얻습니다. 그 후, 용액을 원심 울트라 여과 튜브에 넣고 용액을 1~5분 동안 2, 000배 g에서 원심분리하여 용액을 농축한다.
여과 용기를 비우고 튜브에 15 밀리리터의 저장 버퍼를 추가합니다. 샘플을 다시 원심 분리하고 프로세스를 두 번 추가로 반복합니다. 재조합 gtfSI 솔루션은 마침내 약 1 밀리리터에 농축됩니다.
농축액을 미세원심분리기 튜브로 옮기고 섭씨 4도에 보관하십시오. 나머지 기능 복원 프로토콜을 계속 합니다. 본 프로토콜에서, 아가로즈 겔 전기포진은 제1 PCR 및 제2 PCR로부터의 각 앰플리턴의 크기가 예측된 크기에 대응하는 것을 나타낸다.
연쇄상 구균 뮤탄식민지는 두 번째 PCR 제품으로 변형되었고 스펙트럼을 포함하는 뇌 심장 주입 오거 플레이트에 도금되었습니다. 아가로즈 젤에서 실행되는 콜로니 PCR 제품은 각 앰플리턴이 예측 된 크기의 것을 보여줍니다. 고정금속 친화성 크로마토그래피로 정제된 단백질은 SDS-PAGE에 의해 단일 대역으로 관찰되었다.
항 폴리히스티딘 항체를 사용하여 수행된 서양 블롯은 관찰된 밴드가 160킬로달톤의 폴리히스티딘 태그 단백질임을 확인했습니다. 자당 유래 생물막 형성 능력은 1%의 자당이 있는 튜브 벽에 부착된 생물막을 형성한 연쇄상 구균 뮤탄과 연쇄상 구균 뮤탄스 His-gtfC로만 볼 수 있었다. 이것은 연쇄상 구균 mutans 델타 gtfC에서 관찰되지 않았습니다.
그러나, 재조합 gtfSI의 25 마이크로그램을 첨가하여 연쇄상 구균 돌연변이 델타 gtfC에서 부착된 생물막 형성 능력을 회복시켰습니다. 이 방법의 성공은 두 번째 PCR 증폭에 따라 달라지므로 두 번째 PCR 제품은 전기 전구에 의해 확인되어야합니다. 이미, 이 방법에 의해 얻어진 히스티딘 형 단백질은 단백질 단백질 상호 작용과 같은 기능성 산에 소집되고 있다.
개발 후, 이 기술은 유전자 중단과 함께 미생물학 분야의 연구원들이 유전자 기능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
