이 프로토콜은 산후 마우스에서 가장 풍부한 두 개의 가장 풍부한 신경교 세포 인구, 성상 세포 및 미세 리아를 병렬로 추출하는 데 초점을 맞춘 방법을 설명합니다. 우리의 방법은 우리가 같은 조건에서 동일한 추출에 있는 두 세포 모형을 얻고 격리에 집중하기 때문에 성상 세포 및 microglia 격리를 위한 이전에 기술된 프로토콜과 다릅니다, 따라서 실험적인 동물의 사용을 최적화하고 면역학적 맥락에서 이 세포에 대한 상대적 역할의 연구를 향상. 이 프로토콜은 예를 들어 원생동물 기생충 또는 바이러스에 의해 알츠하이머, 파킨슨 및 감염과 같은 중추 신경계의 많은 문맥과 질병에서 microglia 및 성상세포 역할을 더 잘 조사하는 데 유용할 수 있습니다.
동일한 추출에서 두 세포 유형을 획득하고 격리하는 것은 감염 또는 염증과 같은 각 세포 하위 집합 면역 학적 맥락의 비교 역할을 평가하는 것이 바람직하다. 사람들은 특히 뇌 제거 와 신경 조직 세차하는 동안주의해야한다, 그러나 나는이 프로토콜과 비디오 샷으로, 사람들은 투쟁하지 않을 것이라고 생각합니다. 이 프로토콜은 코르티체를 추출하는 동물의 수에 따라 길수 있으므로 약 4 시간 이상을 보낼 준비가되어 있습니다.
첫날에는 순수 HBSS 및 HBSS와 10%의 열 비활성화 FBS를 준비하십시오. 보충 DMEM F12를 준비하고 0.22 미크론 필터로 필터링합니다. 오토클레이브에서 모든 수술 기구를 살균하고 시술 중에 70 %의 에탄올을 사용합니다.
신생아 쥐를 이소플루란으로 담근 면이 들어 있는 밀폐된 챔버에 5분간 심오한 마취를 하십시오. 마우스 새끼를 70%에탄올로 스프레이하고 가위로 동물을 참수합니다. 두개골을 따라 가위로 처릿 컷을 만들어 뇌를 드러내십시오.
뇌의 무결성을 유지하기 위해 마이크로 주걱을 사용하여 뇌를 제거합니다. 마른 6센티미터 직경페트리 접시에 뇌를 놓습니다. 마이크로 주걱을 사용하여 후각 전구와 소뇌를 제거하십시오.
피질을 HBSS 2밀리리터와 10%의 FBS가 포함된 다른 페트리 접시로 이동합니다. 멸균 가위로 뇌 조직을 잘라내고 P1000 마이크로파이프를 사용하여 각 뇌 조직을 HBSS플러스 10%FBS로 다른 15밀리리터 원문 튜브로 옮길 수 있습니다. 필요한 경우 HBSS와 10%FBS를 사용하여 최종 볼륨을 2밀리리터로 채웁니다.
각 튜브에 대해 3 밀리리터의 HBSS와 10%의 FBS로 절단 된 뇌 조직을 씻으십시오. 절충 후, 신중하게 상체를 제거합니다. HBSS와 10%FBS를 3회 추가로 세척합니다.
그런 다음 순수 HBSS 3 밀리리터로 세 번 씻으시면 됩니다. 절충 후, 신중하게 상체를 제거합니다. 다음으로, 트립신 3밀리리터를 넣고 튜브를 섭씨 37도에서 30분간 수조에 넣고 5분마다 튜브를 부드럽게 흔들어 놓습니다.
이것은 수집된 조직을 소화합니다. 거품을 피하십시오. 트립신을 비활성화하려면, HBSS의 세 밀리리터 플러스 10 %FBS와 조직의 감소 후 조직을 씻어, 신중하게 상체를 제거합니다.
이 세척을 세 번 반복합니다. 그런 다음 순수 HBSS의 3 밀리리터로 조직을 씻고 두 번 더 반복하십시오. 조직의 절제 후, 신중하게 상체를 제거합니다.
순수 HBSS 의 일곱 밀리리터를 추가하고 파이펫의 연속 구절을 통해 조직을 균질화, 먼저 10 밀리리터 세로지 피펫, 그리고 5 밀리리터 파이펫, 그리고 마지막으로 P1000 마이크로 파이프로. 균질화 후, 4섭씨에서 5분간 450배g의 원심분리합니다. 상체를 버리고 각 튜브에 대해 HBSS 4 밀리리터와 10 %의 FBS로 펠릿을 다시 중단하십시오.
최적의 세포 배양 접착을 위해 상업적으로 전처리된 T75 플라스크로 세포를 이송한다. 플라스크를 37°C의 인큐베이터에 5%의 이산화탄소를 30분간 보관하십시오. 그런 다음 플라스크에 보충된 DMEM F12 10밀리리터를 추가하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 2박 동안 배양합니다.
셋째 날에는 T75 플라스크에서 7밀리리터의 배양 배지를 제거하고 7밀리리터의 신선한 보충 DMEM F12를 추가합니다. 플라스크를 인큐베이터에 반환합니다. 5일째에는 파편과 비부착 세포를 제거하기 위해 T75 플라스크에서 모든 배지를 신선한 DMEM F1214 밀리리터로 교환합니다.
그런 다음 48시간마다 상체6밀리리터를 제거하고 14일째까지 신선한 보충 DMEM F12 배지 7밀리리터를 추가합니다. 14일, 6밀리리터의 상체를 제거하고 7밀리리터의 신선한 보충 DMEM F12 매체를 추가한 후, T75 플라스크를 플라스틱 포장으로 단단히 닫습니다. 200 RPM과 37°C의 바닥 궤도 셰이커에 배치하여 성상세포에서 기계적으로 미생물을 해리시합니다.
15일째에 셰이커에서 플라스크를 꺼내 서 열렬히 씻어 내어 세포 해리를 최적화하고 최대 수의 마이크로글리아를 수확하십시오. 그런 다음 상체를 수집하고 50 밀리리터 원내 튜브로 옮기십시오. 다음으로, 각 플라스크에 4 밀리리터의 트립신을 추가하고 성상세포를 분리하기 위해 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다.
그런 다음 트립신을 비활성화하기 위해 보충 된 DMEM F12의 5 밀리리터를 추가합니다. 플라스크를 자신의 매체로 씻고 내용물들을 50밀리리터 원추형 튜브로 옮겨보십시오. 원심분리기는 4°C에서 5분 동안 450배 g에서 해리된 마이크로글리아 또는 성상세포를 함유한 모든 튜브입니다.
상부체를 폐기합니다. 보충 DMEM F12의 1 밀리 리터와 성상 세포10 보충 DMEM F12의 밀리리터에서 마이크로 글리아 펠릿을 다시 중단. Neubauer 챔버 또는 자동 셀 카운터에서 셀 카운트로 진행합니다.
전처리된 평평한 바닥 세포 배양판에서 원하는 밀도로 DMEM F12를 보충하여 세포를 플레이트. 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 24시간 동안 배양하여 부착할 수 있도록 합니다. 14일째에, 신경교 세포 배양은 기계적인 해리를 겪었습니다.
그것은 성상세포 인구에 대한 89.5 %와 microglia 인구에 대한 96.6 %의 순도로 관찰되었다. C57BL6 마우스의 성상세포및 마이크로글리아는 T.cruzi Y.에 감염된 후 2시간, 48시간, 96시간 후, 챔버는 메탄올로 고정되어 세포 핵마커 DAPI 및 안티 GFAP로 염색하였다. 특정 형광 항체로 표지된 형광 기자 또는 기생충을 표현하는 유전자 변형 기생충의 사용은 세포 핵과 더 잘 구별되기 때문에 면역 형광 현미경 검사를 향상시켰다.
여기에 두 가지 예가 표시됩니다. T.곤디 RH 균주는 비상업적 단일 클론 항체 2C2 항 SSP4 단백질로 염색된 YFP 및 T.cruzi Y 균주를 구성적으로 표현합니다. 세포 응집체를 잃지 않도록 세포를 조심스럽게 씻는 것이 중요합니다.
신경교 세포 감염 후, 다른 파라미터는 상류체에 존재하는 사이토카인 생산을 위한 ELISA, 단백질 발현을 위한 서양 블로팅, RNA 전사 평가를 위한 실시간 정량적 PCR 과 같은 평가될 수 있다. 신경교 세포의 기능에 관련 된 많은 질문, 예를 들어 그들의 신진 대사, 면역 반응, 그리고 세포 생물학 자체는 해결 하 고이 기술에 의해 혜택을 받을 수 있습니다. 모든 원생동물 기생충은 인간 세포뿐만 아니라 배양 마우스 세포를 감염시킬 수 있으므로 이 기생충을 다룰 때주의하는 것이 중요합니다.
