대부분의 건강 상태는 조기에 발견하면 더 잘 관리할 수 있습니다. 접근 가능한 체액에서 사용할 수 있는 바이오마커는 건강 상태를 조기에 발견할 수 있는 가장 유망한 방법입니다. 우리는 인간 뇌에서 작은 세포외 소포체를 통해 방출되는 microRNA 바이오마커를 조사하는 방법이 개선되었다고 보고하고 있습니다.
이 방법을 통해 치매와 같은 질병의 다양한 유전적 하위 유형 간에 작은 세포 외 소포 화물의 차이를 식별하고, 말초액에서 검출될 수 있는 화물 바이오마커 후보를 식별하고, 질병의 조기 진단을 강화할 수 있었습니다. 따라서 이 프로토콜은 효율성, 접근성 및 제품 순도의 균형을 유지하여 다양한 실험실 환경에서 쉽게 재현할 수 있습니다. 특수 장비가 필요하지 않으며 사전 포장된 컬럼이 일관성을 제공합니다.
따라서 모든 바이오마커 결과는 원하는 임상 결과로 쉽게 전환될 것입니다. 새로운 질병 조절 약물이 승인됨에 따라 진단은 환자의 이익을 극대화하기 위해 현재 가능한 것보다 훨씬 더 일찍 이러한 질병을 진단해야 합니다. 이와 같은 방법은 새로운 질병 관련 microRNA 바이오마커를 식별하여 특정 치료 및 관리 옵션을 사용하여 더 나은 건강 관리를 초래할 수 있습니다.
우리는 기존 역량을 활용하여 체액에서 발견되는 이질적인 혼합물 내에서 특정 세포 유형에서 방출된 microRNA 바이오마커를 검출할 수 있는 조직 및 세포 유형별 마커를 식별하는 방법을 개발할 것입니다. 먼저 냉장판에 소독된 메스를 사용하여 250mg의 냉동 뇌 조직을 얇게 자릅니다. 동면 용액에서 밀리리터당 75 단위 콜라겐 분해 효소 유형 III의 2 밀리리터를 조직에 첨가합니다.
각 샘플을 섭씨 37도의 수조에 20분 동안 넣습니다. 5분 표시에서 샘플을 두 번 뒤집어 혼합합니다. 10분 표시에서 10ml 플라스틱 일회용 스트라이프를 사용하여 샘플을 세 번 부드럽게 피펫팅합니다.
그런 다음 각 샘플을 얼음 위에 놓고 프로테아제 억제제 칵테일과 인산가수분해효소 억제제를 각 샘플에 추가합니다. 각 뇌 조직 샘플을 섭씨 4도에서 10분 동안 300G에서 원심분리합니다. 상층액을 수집합니다.
그런 다음 섭씨 4도에서 15분 동안 2000G에서 원심분리합니다. 이제 상층액을 수집하여 0.22 마이크로 미터 필터를 통해 여과합니다. 다음 10, 4 섭씨 온도에 48 분 동안 000G에 여과액을 원심 분리하십시오.
상등액을 채취한 후 각 샘플에 침전 버퍼를 2:1 비율로 추가합니다. 그리고 섭씨 4도에서 밤새 샘플을 배양합니다. 다음 10, 4 섭씨 온도에 96 분 동안 000G에 각 표본을 분리기하십시오.
그리고 펠릿을 100마이크로리터의 세포외 소포가 없는 PBS에 재현탁시킵니다. 사전 준비된 크기 배제 크로마토그래피 또는 SEC 컬럼을 실온에서 15분 동안 평형을 이룹니다. 평형 후 컬럼 상단에서 방부제 완충액을 제거하고 250마이크로리터의 세포외 소포가 없는 PBS를 사용하여 컬럼을 두 번 세척합니다.
그런 다음 재현탁된 펠릿을 컬럼에 추가하고 50G에서 30초 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 버린 후 180마이크로리터의 EV free PBS를 추가하고 50G에서 컬럼을 1분 동안 원심분리하여 뇌에서 파생된 작은 세포외 소포체가 용리될 수 있도록 합니다. 작은 세포외 소포체를 이가 생성하려면, 분리된 작은 세포외 소포체 샘플을 용해 및 추출 완충액과 동일한 비율로 희석합니다.
희석된 시료를 섭씨 4도에서 30분 동안 교반합니다. 다음 14, 15 분 동안 000G에 표본을 원심 분리하십시오. 단백질 상층액을 수집하고 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
나노입자 추적 분석을 수행하려면 1에서 1000의 희석 계수를 사용하여 PBS에서 각 시료를 희석합니다. 샘플을 NTA 기기에 주입합니다. 그리고 550나노미터의 파장에서 샘플을 판독하도록 기기를 설정합니다.
입자 수량을 사용하여 MISEV 지침에 따라 펨토 그램으로 표시되는 입자당 단백질의 양을 측정합니다. 다음으로, PBS에서 셀 마스크 오렌지 또는 CMO 염료를 1 내지 1000의 희석 계수로 희석합니다. 그런 다음 1 - 10 희석 계수를 사용하여 CMO 염료를 작은 세포외 소포 샘플로 희석합니다.
그리고 혼합물을 섭씨 4도에서 30분 동안 어둠 속에서 배양합니다. 이제 1 - 1000 희석 계수에서 PBS를 사용하여 CMO 염료 작은 세포외 소포 혼합물을 더 희석합니다. NTA 기기를 사용하여 550나노미터의 파장에서 각 작은 세포외 소포체 샘플의 CMO 염료를 판독합니다.
형광 항체 추적을 위해 1 - 10 희석 계수를 사용하여 PBS에서 각 테트라스팬과 형광 항체를 희석합니다. 그런 다음 1 - 10 희석 계수를 사용하여 작은 세포외 소포 샘플로 각 항체 염료를 희석합니다. 그리고 혼합물을 섭씨 4도에서 2시간 동안 어둠 속에서 배양합니다.
다음으로, 1 내지 1000 희석 계수로 PBS를 사용하여 두 번째 항체 혼합물을 희석합니다. NTA 기기를 사용하여 550나노미터의 파장에서 작은 세포외 소포체 샘플의 형광 항체 신호를 판독합니다. 웨스턴 블롯 분석에서 뇌 유래의 작은 세포외 소포체에서 양성 마커 CD9, CD63, CD81, Flotilla One 및 TSG101의 존재가 확인되었으며, Calnexin은 없었으며 이는 세포 오염이 없음을 나타냅니다.
나노 입자 추적 분석은 고립된 입자의 크기가 50에서 200나노미터 사이이며 피크 농도는 약 100나노미터인 것으로 나타났습니다. CMO 염색 데이터에 따르면 입자의 52.35%는 지질 이중층을 가지고 있으며, 그 중 34.66%는 CD9, 15.49%는 CD63, 12.01%는 CD81을 함유하고 있습니다.
