우리 연구실에서는 초파리를 모델 유기체로 사용하여 화학 물질 감지에서 행동에 미치는 영향에 이르기까지 신경 회로를 통해 맛 정보가 어떻게 처리되는지 연구합니다. 우리는 이 이미징 프로토콜을 사용하여 아미노산에 반응하는 미각 세포를 식별하고 다양한 내부 상태가 미각 세포가 이러한 필수 영양소에 반응하는 방식을 조절하는지 확인하고 있습니다. 이 칼슘 이미징 접근 방식의 장점은 내부 상태가 그대로 유지되는 깨어 있는 동물의 특정 세포에서 미각에 의한 신경 반응을 기록할 수 있다는 것입니다.
이제 우리는 새로운 초파리 전뇌 커넥톰에서 추정되는 미각 회로를 식별하고 이 칼슘 이미징 접근 방식을 사용하여 생체 내에서 기능적 신경 역학을 확인할 수 있습니다. 시작하려면 마취된 파리를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 해부 가위를 사용하여 대퇴 경골 관절의 중간 다리와 뒷다리를 제거하고 전자골에서 4개의 다리를 제거합니다.
뭉툭한 집게를 사용하여 날개로 파리를 집어 올려 몸체는 아래에 유지하면서 머리가 이미징 챔버의 목표 자궁 경부 슬롯 위에 위치하도록 합니다. 가위의 뭉툭한 면과 뭉툭한 집게를 사용하여 머리와 흉부를 동시에 슬롯에 부드럽게 밀어 넣습니다. 플라이가 슬롯 내부에 단단히 고정되면 뒤쪽으로 밀고 챔버 앞쪽을 향하도록 부드럽게 위치를 변경합니다.
이쑤시개 끝에 매니큐어를 한 방울 떨어뜨리고 파리의 머리를 이미징 챔버에 고정하기 위해 얇게 코팅합니다. 한 손으로 왁서를 집어 들고 끝에 작은 왁스 방울을 모으십시오. 반면에 반쯤 날카로운 집게를 사용하여 한쪽 상악 손바닥을 잡고 주둥이를 부드럽게 당겨서 완전히 펴십시오.
왁스가 흐르기 시작할 때까지 왁서의 끝을 바닥 근처의 챔버에 대십시오. 바닥과 왁스 아래쪽으로 이동하여 축의 절반 아래로 왁스를 바르고 labellar sensilli와의 접촉을 피하십시오. 그런 다음 주둥이를 가능한 한 똑바로 완전히 펴십시오.
이제 장착된 파리를 습도 챔버에 60분 동안 넣어 회복합니다. 습도 챔버에서 파리를 제거하십시오. 매우 날카로운 집게를 사용하여 양쪽 더듬이를 집고 큐티클을 꼬집어 구멍을 만든 다음 날카로운 집게의 한쪽 면을 삽입합니다.
큐티클 아래에 있는 집게를 움직여 관심 있는 뇌 영역을 덮고 있는 영역에서 큐티클을 제거합니다. 노출된 뇌를 씻으려면 약 100마이크로리터의 인공 혈림프액(AHL)을 머리에 첨가하십시오. 씻은 후에는 AHL을 제거하고 뇌가 건조해지는 것을 방지하기 위해 얇은 층을 남깁니다.
날카로운 집게를 사용하여 공기 주머니와 뇌를 덮고 있는 큰 파편을 제거합니다. 식하 영역(SEZ)을 구체적으로 이미지화하려면 매우 날카로운 집게를 사용하여 근처의 기저부와 뇌를 통과하는 지점에서 식도를 절단합니다. SEZ를 노출시키려면 이 부분을 제거하십시오.
해부 현미경 아래에서 10 x 20mm 커버 슬립을 이미징 챔버의 각진 슬롯에 놓습니다. 약 2마이크로리터의 물 또는 다른 음의 대조군을 모세관 튜브에 넣습니다. 절개된 파리를 찾고 10x 공기 침수 명시야 대물렌즈를 사용하여 라벨럼에 초점을 맞춥니다.
모세관을 10x view 아래의 labellum에 맞춥니다. 모세관 위치를 라벨 바로 앞에 두고 가깝지만 닿지 않도록 합니다. 스테이지를 이동하여 관심 있는 뇌 영역을 중앙에 배치합니다.
40x 대물렌즈와 같은 더 높은 배율의 침수 대물렌즈로 전환하십시오. 뇌 위에 약 200마이크로리터의 AHL을 추가하여 침수 대물렌즈와 접촉을 보장합니다. 488 나노미터 레이저 출력으로 전환하여 관심 영역에서 GCaMP 발현을 찾습니다.
최소 5초의 기준선 형광을 수집한 후 모세관이 5초 동안 라벨을 덮도록 자극기를 수동으로 움직입니다. 자극을 제거하고 원하는 만큼 계속 캡처합니다. 그런 다음 AHL을 제거하고 10x 명시야로 돌아가 커버 슬립, 자극기 및 라벨이 올바른 위치에 있는지 확인합니다.
그런 다음 이미징 챔버를 제거하고 보풀이 없는 천을 사용하여 모세관에서 첫 번째 용액을 제거합니다. 피펫을 물로 씻어내고 약 2마이크로리터의 다음 맛을 모세관에 피펫으로 넣습니다. Gr64f GCaMP 파리의 상대적 형광 변화는 물에 비해 자당 자극에서 유의하게 높았으며, 이는 단맛 미각 수용체 뉴런의 강력하고 지속적인 반응을 보여주었습니다.
자당 자극에 대한 상대적 피크 형광은 물에 대한 형광보다 훨씬 컸습니다. Gr66a GCaMP 파리의 형광 변화는 물보다 카페인 자극에서 유의하게 높았으며, 이는 카페인 발생 및 제거에 대한 반응을 보여주었습니다. Gr66a 파리에서 축삭 말단의 투영 패턴은 Gr64f의 투영 패턴과 구별되어 쓴맛과 설탕을 감지하는 미각 수용체 뉴런의 해부학적 분리를 보여주었습니다.
