Nasz obecny zakres badań polega na zbadaniu roli rytmów okołodobowych w proliferacji i różnicowaniu komórek nabłonka jelitowego. Próbujemy ustalić, czy zegar okołodobowy reguluje proliferację i różnicowanie komórek z jelitowych komórek macierzystych. Protokół ten przedstawia metodę monitorowania w czasie rzeczywistym dla badań okołodobowych w trójwymiarowych organoidach przy użyciu testu bioluminescencji.
W przeciwieństwie do przeprowadzania testu bioluminescencji w konwencjonalnej dwuwymiarowej hodowli komórkowej, to podejście umożliwia nam badanie rytmów okołodobowych i ich funkcji w bardziej fizjologicznie istotnym modelu organoidowym. Nasze odkrycia wskazują na destrukcyjne rytmy okołodobowe w warunkach wzbogaconych w komórki macierzyste, jednocześnie wykazując silne oscylacje okołodobowe w zróżnicowanych enteroidach jelitowych człowieka, co sugeruje przebudowę maszynerii zegara okołodobowego z komórek macierzystych na komórki zróżnicowane. Wykorzystanie organoidów pochodzących od pacjentów z okołodobowymi bioluminescencyjnymi reporterami pomoże nam pogłębić naszą wiedzę na temat rytmów okołodobowych w narządach obwodowych i różnych stanach chorobowych.
Na początek ułóż wszystkie materiały potrzebne do pakowania ludzkich enteroidów jelitowych lub HIE na platformie roboczej. Wymieszaj HIE z matrycą hodowli 3D o obniżonym współczynniku wzrostu. Wysiewaj mieszaninę na 24-dołkową płytkę z trzema kroplami po 10 mikrolitrów matrycy hodowlanej 3D na dołek i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnie dodaj 350 mikrolitrów pożywki wzrostowej HIE. Po siedmiu dniach zbierz HIE z czterech studzienek do 1,5-mililitrowych probówek. Odwirować HIE przy 2000 G przez 40 sekund, aby usunąć zanieczyszczenia.
Za pomocą pipety usuń nadmiar matrycy hodowlanej 3D z probówki. Dodaj 0,5 mililitra zimnego PBS do probówki. Używając jednomililitrowej strzykawki insulinowej, zastosuj turbulencje fizyczne za pomocą strzykawki do 10 razy, aby oddzielić HIEs.
Odwirować zdysocjowane HIE przy 2000 G przez 40 sekund i delikatnie usunąć supernatant. Następnie umieść probówkę na lodzie na około trzy minuty. Dodaj matrycę hodowlaną 3D o obniżonym współczynniku wzrostu do probówki i wymieszaj ją z osadem.
Zasiej mieszaninę HIE w matrycy hodowlanej 3D na środku okrągłej naczynia o średnicy 35 milimetrów. Inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut, aby zestalić matrycę hodowli 3D. Następnie dodaj dwa mililitry wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej organoidów jelitowych do naczynia i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 48 godzin.
Trzeciego dnia zastąp pożywkę wzrostową dwoma mililitrami wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 48 godzin. W piątym dniu zastąp pożywkę enteroidową dwoma mililitrami wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej i kontynuuj inkubację przez 24 godziny. Rozpocząć od wyjęcia z inkubatora naczynia zawierającego zróżnicowane HIEs.
Aby zsynchronizować zegar molekularny enteroidów, dodaj dwa mikrolitry 100 mikromolowego deksametazonu do naczynia i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę. Podczas inkubacji ustaw procent dwutlenku węgla i temperaturę luminometru odpowiednio na 5% i 37 stopni Celsjusza. Po synchronizacji zegara uzupełnij enteroidy trzema mililitrami wstępnie podgrzanego podłoża różnicującego zawierającego 200 mikromolową D-lucyferynę.
Umieścić naczynie w ośmiodołkowym stole do naczyń inkubatora i przykryć stół z naczyniami na próbki pokrywką. Umieść dwie komory nawilżacza z mokrą chusteczką lub gąbką na stole z naczyniami na próbki i zamknij pokrywę urządzenia. W oprogramowaniu do bioluminescencji kliknij zakładkę warunek, aby dostosować ustawienia liczby naczyń, czasu pomiaru, przetwarzania w tle i typu filtra.
Następnie kliknij OK, aby zapisać ustawienia. Aby rozpocząć eksperyment, kliknij kartę uruchamiania, a następnie przycisk Start. Następnie kliknij zakładki surowe, filtrowane szumami lub detrendowane u góry ekranu, aby obserwować sygnały dla wybranych danych.
Po nagraniu kliknij przycisk zatrzymania, aby zatrzymać bieg. Przejdź do zakładki plik, wybierz zapisz jako i zapisz dane w formacie Kronos. Na koniec kliknij plik i wybierz eksportuj jako format Excel, aby wyeksportować dane do arkusza kalkulacyjnego.
Zapis bioluminescencyjny oceniał rytmiczność okołodobową HIE w warunkach wzbogaconych komórkami macierzystymi i indukujących różnicowanie. Szybka analiza transformaty Fouriera wykazała, że w warunkach różnicowania bioluminescencja lucyferazy Bmal1 wykazywała silne oscylacje okołodobowe ze średnią okresowością 22,92 godziny. Z kolei HIE wykazały zakłócony rytm okołodobowy w warunkach wzbogaconych komórkami macierzystymi.
