تم الحصول على الأمعاء المعوية البشرية من مختبر الدكتور مايكل هيلمراث في المركز الطبي لمستشفى سينسيناتي للأطفال (CCHMC). تم دعم هذا العمل من قبل R01 DK11005 (CIH) والتمويل التجريبي لمركز السرطان بجامعة سينسيناتي. نحن ممتنون لدعم التصوير من جامعة سينسيناتي لايف ميكروسكوب كور (NIH S10OD030402).

تمت الموافقة على جميع التجارب التي تستخدم الأنسجة البشرية لتوليد HIEs من قبل IRB في CCHMC (IRB # 2014-0427). انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد المستخدمة في هذا البروتوكول.
ملاحظة: لتوضيح الإجراء الموضح في هذا البروتوكول ، استخدمنا Bmal1-luc الأمعاء المعوية البشرية (HIEs). خضعت هذه المعوية لعملية نقل عدسية مستقرة22 مع بلازميد مراسل pABpuro-BluF ، والذي يحتوي على مروج Bmal1 المنصهر مع luciferase ، مما يدل على نشاط مروج Bmal1 21.
1. نقل الفيروسات النسرية
<ol><li>إجراء نقل الفيروسالعدسي 22 تحت ظروف غنية بالخلايا الجذعية ل HIEs. على وجه التحديد ، تأكد من تكوين كرويات في HIEs في غضون 3-4 أيام بعد المرور في وسائط نمو الأمعاء ، مما يخلق ظروفا غنية بالخلايا الجذعية.</li>
	<li>بعد نقل الفينجين22 ، قم بإجراء اختيار المضادات الحيوية باستخدام 2 ميكروغرام / مل بوروميسين ، واستعد HIEs المقاومة للبوروميسين ، ومررها بكثافة عالية نسبيا (أي بئر واحد في بئرين) لمدة 2-3x. إذا كان معدل نمو HIEs بطيئا ، أضف مثبطات 10 μM ROCK (Y-27632) ومثبطات 10 μM GSK-3 (CHIR-99021) إلى وسط نمو الأعضاء المعوية.</li>
</ol>2. إعداد المواد العضوية لمقايسة التلألؤ الحيوي
<ol><li>يوم 1: قم بتمرير HIEs إلى أطباق مستديرة مقاس 35 مم.<ol><li>باختصار ، لتوسيع HIEs ، امزج HIEs مع مصفوفة ثقافة ثلاثية الأبعاد مخفضة عامل النمو (GFR) وقم بزرعها على 24 لوحة بئر مع ثلاث قطرات من 10 ميكرولتر من مصفوفة الثقافة ثلاثية الأبعاد لكل بئر. أضف 350 ميكرولتر من وسط نمو HIE وقم بتغييره كل يوم. ملاحظة: كثافة HIE في مصفوفة ثقافة 3D أمر بالغ الأهمية لنمو المعوية. تقريبا ، يجب أن يتجاوز عدد الكرويات أكثر من 50 في كل قطرة. إذا كان الرقم منخفضا ، فإن معدل نمو HIE يتأثر سلبا.</li>
		<li>عندما تنمو HIEs بشكل كاف (حوالي 7 أيام بعد المرور) ، قم بجمع HIEs من أربعة آبار في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل.</li>
		<li>اغسل HIEs باستخدام PBS البارد باستخدام جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة (2000 × جم) لمدة 40 ثانية تدور بسرعة لإزالة الحطام ومصفوفة الثقافة ثلاثية الأبعاد المفرطة بواسطة الماصة.</li>
		<li>أضف 0.5 مل من برنامج تلفزيوني بارد إلى الحبيبات وقم بتطبيق الاضطراب الجسدي عن طريق حقن ما يصل إلى 10 مرات باستخدام حقنة أنسولين سعة 1 مل لفصل HIEs.</li>
		<li>قم بتدوير HIEs المنفصلة باستخدام جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة كما في الخطوة 2.1.3 وقم بإزالة المادة الطافية برفق بواسطة ماصة. بعد ذلك ، ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق مع حبيبات HIE على الثلج ليبرد لمدة 3 دقائق تقريبا.</li>
		<li>أضف مصفوفة ثقافة GFR 3D إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق وامزجها مع حبيبات HIE. ملاحظة: احسب مقدار مصفوفة الثقافة ثلاثية الأبعاد بناء على عدد الأطباق المستديرة مقاس 35 مم التي سيتم استخدامها للتجربة. نحن عموما البذور 30 ميكرولتر من قطرات مصفوفة الثقافة 3D لكل طبق مستدير.</li>
		<li>قم بزرع خليط HIEs ومصفوفة الثقافة ثلاثية الأبعاد في وسط الطبق المستدير مقاس 35 مم واحتضان الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لترسيخ مصفوفة الثقافة ثلاثية الأبعاد. ملاحظة: يجب تحديد كثافة HIEs البذر تجريبيا. بناء على شدة التلألؤ الحيوي ، يمكن للمرء تحديد عدد HIEs خلال هذه العملية.</li>
		<li>أضف 2 مل من وسط النمو العضوي المعوي المسخن مسبقا إلى كل طبق واحتضان الأطباق في حاضنة CO2 حتى الخطوة التالية.</li>
	</ol></li>
	<li>اليوم 3: بدء التمايز<ol><li>لبدء تمايز HIEs ، قم بإزالة وسط النمو وإضافة 2 مل من وسط التمايز المسخن مسبقا. ملاحظة: انظر الجدول 1 للحصول على وصفات وسائط تمايز HIE23.</li>
	</ol></li>
	<li>اليوم 4: لا توجد عملية إضافية مطلوبة.</li>
	<li>اليوم 5: استبدل وسط المعوي ب 2 مل من وسط التمايز المسخن مسبقا.</li>
	<li>اليوم 6: مزامنة الساعة وتسجيل التلألؤ الحيوي<ol><li>لمزامنة الساعة الجزيئية للمعوية ، أضف 2 ميكرولتر من 100 ميكرومتر ديكساميثازون (Dex) لجعل التركيز النهائي 100 نانومتر في كل طبق ثم احتضان الأطباق في حاضنة CO2 (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لمدة 1 ساعة24.</li>
		<li>أثناء إعادة ضبط Dex ، قم بإعداد مقياس الإنارة المحتضن. تحقق من ثاني أكسيد الكربون2 ودرجة حرارة مقياس الإنارة الحاضن واضبطها على 5٪ و 37 درجة مئوية على التوالي. ملاحظة: يقترح مسح الجزء الداخلي من مقياس الإنارة الحاضن بنسبة 70٪ كحول قبل وبعد كل استخدام للآلة لإبقائها معقمة.</li>
		<li>بعد تزامن الساعة ، قم بتجديد المعوية ب 3 مل من وسط التمايز المسخن مسبقا الذي يحتوي على 200 ميكرومتر D-luciferin. ملاحظة: نظرا لأن لوسيفيرين حساس للضوء ، يجب لف الوسط المحتوي على لوسيفيرين بورق القصدير وتسخينه مسبقا في حمام حراري بدرجة حرارة 37 درجة مئوية قبل وضعه على الطبق.</li>
		<li>ضع الأطباق في طاولة أطباق مكونة من 8 آبار لمقياس الإنارة المحتضن وقم بتغطية طاولة أطباق العينة بغطاءها. ضع غرفتي ترطيب بمنديل مبلل أو إسفنجة أعلى طاولة أطباق العينة. هذه عملية لمرة واحدة. ملاحظة: بعد بدء التجربة ، يجب إبقاء غطاء مقياس الإنارة الحاضن مغلقا حتى يتم إنهاء التجربة. تأكد من تبليل المناديل / الإسفنج بما فيه الكفاية.</li>
		<li>أغلق غطاء الجهاز وابدأ البرنامج لقياس التلألؤ الحيوي لعدد الأيام والدقة المطلوبة.<ol><li>في البرنامج ، حدد إعدادات الحالة بالنقر فوق علامة التبويب الحالة واضبط الإعدادات على هذه اللوحة: عدد الأطباق ووقت القياس ومعالجة الخلفية ونوع الفلتر. ملاحظة: لهذا العرض التوضيحي ، اخترنا جميع الأطباق من A إلى H ؛ وقت القياس الافتراضي ، والذي يحدده البرنامج بناء على عدد الأطباق ؛ وقت الانتظار لمعالجة الخلفية ، ونوع المرشح F0. نظرا لوجود ثلاثة خيارات للمرشح ، يمكن قياس ثلاثة ألوان مضيئة في وقت واحد.</li>
			<li>بعد إدخال جميع الإعدادات المناسبة بناء على التجربة ، احفظ الإعدادات بالنقر فوق موافق.</li>
			<li>لبدء تشغيل التجربة، انقر على علامة التبويب تشغيل | الزر "ابدأ " (رمز المثلث الأخضر). لاحظ البيانات على أنها خام أو تمت تصفيتها من الضوضاء أو تم إلغاء اتجاهها عن طريق إجراء التحديدات المناسبة أعلى شاشة البرنامج أثناء إجراء التجارب. انقر فوق علامات التبويب الخام أو Noise Filtered أو Detrended لمراقبة البيانات المحددة.</li>
			<li>مراقبة الإشارات لمدة تصل إلى 5 أيام. ملاحظة: بعد 5 أيام من المراقبة في مقياس الإنارة الحاضن ، قد تبدأ الأمعاء في الموت بسبب نضوب الوسائط. لمنع أي اضطراب يومي محتمل أثناء التجربة ، لا نقوم بإجراء تغيير في الوسائط طوال مدة التجربة.</li>
			<li>في نهاية التجربة ، أوقف التشغيل بالنقر فوق الزر إيقاف (رمز المربع الأزرق) ، وانتقل إلى علامة التبويب ملف ، وانقر فوق حفظ باسم. حفظ البيانات بتنسيق Kronos ؛ قم بتصدير البيانات إلى جدول بيانات في قسم الملف بالنقر فوق الخيار ملف ثم تحديد تصدير بتنسيق Excel ضمن ملف لمزيد من التحليل.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

تحسين الأمعاء المعوية البشرية لدراسات إيقاع الساعة البيولوجية

<ol>
	<li>Cox, K. H., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clock+genes+and+the+transcriptional+architecture+of+the+clock+mechanism.">Circadian clock genes and the transcriptional architecture of the clock mechanism.</a> J Mol Endocrinol. 63 (4), R93-R102 (2019).</li><li>Ayyar, V. S., Sukumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms:+Influence+on+physiology,+pharmacology,+and+therapeutic+interventions.">Circadian rhythms: Influence on physiology, pharmacology, and therapeutic interventions.</a> J Pharmacokinet Pharmacodyn. 48 (3), 321-338 (2021).</li><li>Reppert, S., Weaver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+circadian+timing+in+mammals.">Coordination of circadian timing in mammals.</a> Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).</li><li>Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+architecture+of+the+mammalian+circadian+clock.">Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock.</a> Nat Rev Genet. 18 (3), 164-179 (2017).</li><li>Wolff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+age-dependent+and+tissue-specific+circadian+transcriptome+in+male+mice.">Defining the age-dependent and tissue-specific circadian transcriptome in male mice.</a> Cell Rep. 42 (1), 111982 (2023).</li><li>Ruben, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+tissue-specific+rhythmically+expressed+human+genes+has+potential+applications+in+circadian+medicine.">A database of tissue-specific rhythmically expressed human genes has potential applications in circadian medicine.</a> Science Trans Med. 10 (458), 8806 (2018).</li><li>Huang, S., Lu, Q., Choi, M. H., Zhang, X., Kim, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+real-time+monitoring+of+circadian+oscillations+in+adult+mouse+brain+slices+to+study+communications+between+brain+regions.">Applying real-time monitoring of circadian oscillations in adult mouse brain slices to study communications between brain regions.</a> STAR Protoc. 2 (2), 100416 (2021).</li><li>Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+circadian+clock+oscillations+in+primary+cultures+of+mammalian+cells+using+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+strategy.">Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy.</a> BMC Biotechnol. 10 (3), (2010).</li><li>Choy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+noninvasive+fluorescent+and+bioluminescent+small+animal+optical+imaging.">Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging.</a> Biotechniques. 35 (5), 1022-1030 (2003).</li><li>Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+destabilized+firefly+luciferase+enzyme+for+measurement+of+gene+expression.">Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression.</a> Biotechniques. 29 (3), 590-598 (2000).</li><li>Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cell-autonomous+circadian+clock+rhythms+of+gene+expression+using+luciferase+bioluminescence+reporters.">Monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters.</a> J Vis Exp. (67), e4234 (2012).</li><li>Yoo, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERIOD2::LUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues.">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).</li><li>Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+individual+fibroblasts+reveals+persistent,+independently+phased+circadian+rhythms+of+clock+gene+expression.">Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression.</a> Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).</li><li>Lee, S., Hong, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+model+systems+to+investigate+circadian+clock-related+diseases+and+treatments.">Organoids as model systems to investigate circadian clock-related diseases and treatments.</a> Front Genet. 13, 874288 (2022).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li><li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment.">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> J Mol Med. 95 (7), 729-738 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Rosselot, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+and+function+of+the+circadian+clock+in+intestinal+organoids.">Ontogeny and function of the circadian clock in intestinal organoids.</a> EMBO J. 41 (2), 106973 (2021).</li><li>Corr&#242;, C., Novellasdemut, L., Li, V. S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+organoids.">A brief history of organoids.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 319 (1), C151-C165 (2020).</li><li>Brown, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+period+length+of+fibroblast+circadian+gene+expression+varies+widely+among+human+individuals.">The period length of fibroblast circadian gene expression varies widely among human individuals.</a> PLos Biol. 3 (10), e338 (2005).</li><li>Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L. M., Montenegro-Miranda, P. S., Vanden Brink, G. R., Heijmans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+lentiviral+transduction+and+downstream+analysis+of+intestinal+organoids.">A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids.</a> J Vis Exp. (98), e52531 (2015).</li><li>Criss, Z. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drivers+of+transcriptional+variance+in+human+intestinal+epithelial+organoids.">Drivers of transcriptional variance in human intestinal epithelial organoids.</a> Physiol Genomics. 53 (11), 486-508 (2021).</li><li>Izumo, M., Sato, T. R., Straume, M., Johnson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analyses+of+circadian+gene+expression+in+mammalian+cell+cultures.">Quantitative analyses of circadian gene expression in mammalian cell cultures.</a> PLoS Comput Biol. 2 (10), e136 (2006).</li><li>Hara-Miyauchi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+system+for+dynamic+imaging+of+cell+and+animal+behavior.">Bioluminescent system for dynamic imaging of cell and animal behavior.</a> Biochem Biophys Res Commun. 419 (2), 188-193 (2012).</li><li>Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+in+live+cells+and+animals.">Bioluminescence imaging in live cells and animals.</a> Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).</li><li>Xu, P., Elizalde, M., Masclee, A., Pierik, M., Jonkers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticosteroid+enhances+epithelial+barrier+function+in+intestinal+organoids+derived+from+patients+with+Chron's+disease.">Corticosteroid enhances epithelial barrier function in intestinal organoids derived from patients with Chron's disease.</a> J Mol Med (Berl). 99 (6), 805-815 (2021).</li><li>AlMusawi, S., Ahmed, M., Nateri, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+cell-cell+communication+and+signaling+in+the+colorectal+cancer+microenvironment.">Understanding cell-cell communication and signaling in the colorectal cancer microenvironment.</a> Clin Transll Med. 11 (2), 308 (2021).</li></ol>

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

يوفر اختبار التلألؤ الحيوي العديد من المزايا للتحقيق في إيقاعات الساعة البيولوجية ، الأمر الذي يتطلب جمع البيانات من تجارب الدورة الزمنية طويلة الأجل. أولا ، يمكن الباحثين من مراقبة التعبير الجيني أو البروتين محل الاهتمام أثناء تحرك الخلايا وتكاثرها. دون إجراء تعديلات غير ضرورية أو تعطي...

الساعة البيولوجية جميع الكائنات الحية ، من البكتيريا إلى الثدييات ، لها علاقة معقدة وديناميكية مع بيئتها. في إطار هذه العلاقة ، يعد التكيف مع التغيرات البيئية أمرا بالغ الأهمية لبقاء الكائنات الحية. تمتلك معظم الكائنات الحية إيقاعات يومية تمكنها من التكيف وتحسين وظائفها مع الدورات النهارية التي تبلغ حوالي 24 ساعة. الساعة البيولوجية هي شبكة هرمية من الساعات المركزية والمحيطية التي تعمل بالتعاون للحفاظ على التوازن الفسيولوجي والحفاظ على تزامن الكائنات الحية مع التغيرات اليومية 1,2. في الثدييات ، تتلقى الساعة المركزية أو الرئيسية الموجودة في النواة فوق التصالبية (SCN) إشارات خارجية ، مثل الضوء ، وتنقل المعلومات إلى الساعات الطرفية عبر تفاعل متقدم لمسارات الإشارات العصبية والخلطية3. بالإضافة إلى الساعة المركزية ، تمتلك الأنسجة المحيطية آلية الساعة البيولوجية المستقلة للخلايا الخاصة بها ، والتي يتم الحفاظ عليها بواسطة حلقة التغذية المرتدة السلبية النسخية (TTFL) التي تنظم الجينات التي يتم التحكم فيها على مدار الساعة الخاصة بالأنسجة (CCGs)4,5. تنتج هذه الآلية الجزيئية ما يقرب من 24 ساعة من الإيقاع في الأحداث الخلوية والفسيولوجية ، مثل التعبيرات الجينية ومسارات الإشارات والاستجابات المناعية والهضم. الساعة البيولوجية موجودة في جميع خلايا الثدييات تقريبا ، وقد ثبت أن ما يصل إلى 50٪ من أنماط التعبير عن الجينات تظهر إيقاع الساعة البيولوجية6. بالنظر إلى وفرة CCGs ، قد يؤدي تعطيل آلية الساعة هذه إلى مشاكل فسيولوجية حرجة. ومن ثم ، فإن التحقيقات في إيقاعات الساعة البيولوجية ضرورية لتوضيح الآليات البيولوجية الأساسية وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة.
نظام مراسل لوسيفيراز في الدراسات اليومية ، تعد المراقبة في الوقت الفعلي أمرا بالغ الأهمية لفهم أفضل للسلوكيات والاستجابات الخلوية لأنها تسمح بتتبع التغيرات الزمنية في التعبير الجيني و / أو مستويات البروتين ، مما يوفر نظرة ثاقبة للآليات الجزيئية التي تنظمها الساعة البيولوجية. علاوة على ذلك ، تمكن المراقبة في الوقت الفعلي الباحثين من دراسة آثار التغيرات البيئية على الآليات الجزيئية 7,8. هناك العديد من التقنيات لدراسات المراقبة في الوقت الفعلي ، بما في ذلك مقايسة التلألؤ الحيوي ، والتي تستخدم على نطاق واسع لتتبع التعبير الجيني أو مستويات البروتين بمرور الوقت. مقايسة التلألؤ الحيوي هي طريقة للكشف عن العمليات البيولوجية باستخدام إنتاج الضوء كقراءة. في هذا الفحص ، يتم نقل الإنزيم المؤكسد الذي ينتج التلألؤ الحيوي (على سبيل المثال ، luciferase) إما بشكل عابر أو ثابت إلى الخلايا ذات الأهمية ، ويتم قياس قراءات التلألؤ الحيوي في وجود ركيزة (على سبيل المثال ، لوسيفيرين) بمرور الوقت. على سبيل المثال ، ينتج إنزيم لوسيفيراز تلألؤا حيويا عن طريق أكسدة لوسيفيرين الركيزة في وجود ATP9. نظرا لعمر النصف القصير ، 3-4 ساعات10 ، يعد اليراع لوسيفيراز أداة قوية للدراسات اليومية من حيث توفير مراقبة ديناميكية في الوقت الفعلي مع الحد الأدنى من ضوضاء الخلفية11،12،13. لإدخال الحمض النووي مع مروج موسوم ب luciferase أو إطار قراءة مفتوح (ORF) ، يعد نظام توصيل الجينات الفيروسية العدسية طريقة موثوقة توفر فعالية نقل عالية ، وتكامل مستقر ، ومناعة منخفضة. يوفر النقل المستقر لمراسل التوهج الحيوي تعبيرا قويا في الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة ، مما يولد بيانات متسقة للدراسات اليومية14.
عضوي كنموذج كانت خطوط الخلايا ثنائية الأبعاد التقليدية الخالدة مفيدة في الدراسات البيولوجية التي تتراوح من الكشف عن الآليات الجزيئية الأساسية لإيقاعات الساعة البيولوجية إلى فحص الأدوية. على الرغم من راحة استخدام خطوط الخلايا المتجانسة ، إلا أنها تفتقر إلى الهياكل متعددة الخلايا والتفاعلات بين الخلايا. في المقابل ، فإن الكائنات العضوية هي في المختبر 3D هياكل "شبيهة بالأعضاء" متعددة الخلايا تحاكي بنية العضو في طبق من خلال إظهار التشابه مع بنية الأنسجة في الجسم الحي والخلايا المتعددة ، بما في ذلك أنواع الخلايا الجذعية والسلفية والمتمايزة15,16. إن امتلاك ميزات التنظيم الذاتي وتعدد الخلايا والوظائف يجعل الكائنات العضوية نموذجا رائعا في المختبر يمثل العمليات الخلوية والفسيولوجية التي تحدث في الأنسجة الحقيقية17. يمكن اشتقاق أنواع مختلفة من الكائنات العضوية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات عن طريق التمايز الموجه أو الخلايا الجذعية البالغة التي يتم حصادها من أعضاء مختلفة ، بما في ذلك الأمعاء الدقيقة والدماغ والكبد والرئة والكلى 18,19. نظرا لأن الهياكل العضوية تمتلك بنية ووظيفة حقيقية تشبه الأنسجة مع تعدد الخلايا والتفاعل الديناميكي من خلية إلى خلية ، فهي متفوقة على خطوط الخلايا المتجانسة لفهم الأحداث الخلوية التي تحدث في الأنسجة الحية. كما يمكن التلاعب بالمواد العضوية بسهولة ويمكن زراعتها في ظل ظروف خاضعة للرقابة ، مما يجعلها مفيدة للدراسات اليومية20.
الغرض الرئيسي من هذا العمل هو تقديم طريقة مراقبة في الوقت الحقيقي باستخدام مقايسة التلألؤ الحيوي المصممة خصيصا لدراسة إيقاعات الساعة البيولوجية في عضويات 3D متعددة الخلايا. تم إجراء المراقبة في الوقت الفعلي للأحداث الخلوية باستخدام تقنية فحص التلألؤ الحيوي على نطاق واسع لمزارع الخلايا التي تفتقر إلى التعقيد متعدد الخلايا والاتصالات بين الخلايا الموجودة في الأنسجة الحقيقية. تقدم المواد العضوية 3D فرصا فريدة للتحقيق في وظائف إيقاعات الساعة البيولوجية في الأنظمة متعددة الخلايا في المختبر. على سبيل المثال ، يمكن للمرء أن يبحث في إيقاعات الساعة البيولوجية في المواد العضوية مع تكوين الخلايا المتغيرة أو الكائنات العضوية المشتقة من الأنسجة المريضة للمرضى. يتيح هذا البروتوكول استخدام مقايسة التلألؤ الحيوي للتحقيق في جوانب مختلفة من إيقاعات الساعة البيولوجية في نموذج أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية في المختبر ، وهو المواد العضوية ، مما سيساعدنا على فهم أدوار إيقاعات الساعة البيولوجية في الأعضاء المحيطية بشكل أفضل.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 x 10 Falcon tissue culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-Fine IV Insulin Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-1Bb</td>
			<td>Mfrn: BD 329424</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13122</td>
			<td>GSK-3 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin (potassium salt)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>14681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I Human</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor reduced (GFR) Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40230C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kronos Dio Luminometer Machine</td>
			<td>ATTO Corporation</td>
			<td>AB-2550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pABpuro-BluF reporter plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>46824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/10</td>
			<td>ROCK inhibitor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring circadian oscillations with a bioluminescence reporter in organoids

تمتلك معظم الكائنات الحية إيقاعات يومية ، وهي عمليات بيولوجية تحدث خلال فترة 24 ساعة تقريبا وتنظم ذخيرة متنوعة من العمليات الخلوية والفسيولوجية التي تتراوح من دورات النوم والاستيقاظ إلى التمثيل الغذائي. تعمل آلية الساعة هذه على تقييد الكائن الحي بناء على التغيرات البيئية وتنسق التنظيم الزمني للأحداث الجزيئية والفسيولوجية. في السابق ، ثبت أن إيقاعات الساعة البيولوجية المستقلة يتم الحفاظ عليها حتى على مستوى الخلية الواحدة باستخدام خطوط الخلايا مثل الخلايا الليفية NIH3T3 ، والتي كانت مفيدة في الكشف عن آليات إيقاعات الساعة البيولوجية. ومع ذلك ، فإن خطوط الخلايا هذه عبارة عن ثقافات متجانسة تفتقر إلى تعدد الخلايا والاتصالات القوية بين الخلايا. في العقد الماضي ، تم إجراء عمل مكثف على تطوير وتوصيف وتطبيق المواد العضوية 3D ، والتي هي في أنظمة متعددة الخلايا في المختبر تشبه الهياكل والوظائف المورفولوجية في الجسم الحي . تصف هذه الورقة بروتوكولا للكشف عن إيقاعات الساعة البيولوجية باستخدام مراسل مضيئة بيولوجيا في الأمعاء المعوية البشرية ، مما يتيح التحقيق في إيقاعات الساعة البيولوجية في الأنظمة متعددة الخلايا في المختبر.

Circadian clock 
All organisms, from bacteria to mammals, have a complex and dynamic relationship with their environment. Within this relationship, adaptation to environmental changes is critical for the survival of organisms. Most organisms possess circadian rhythms that enable them to adapt and optimize their functions to diurnal cycles of approximately 24 h. The circadian clock is a hierarchical network of central and peripheral clocks that work in cooperation to maintain physiological homeostasis and keep organisms synchronized with daily changes1,2. In mammals, the central or master clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) receives external cues, such as light, and transmits the information to the peripheral clocks via an advanced interplay of neural and humoral signaling pathways3. In addition to the central clock, peripheral tissues possess their own cell-autonomous circadian clock mechanism, maintained by a transcriptional-translational negative feedback loop (TTFL) regulating tissue-specific clock-controlled genes (CCGs)4,5. This molecular machinery produces approximately 24 h rhythmicity in cellular and physiological events, such as gene expressions, signaling pathways, immune responses, and digestion. The circadian clock is present in almost all mammalian cells, and it has been demonstrated that up to 50% of the genes&#39; expression patterns exhibit circadian rhythmicity6. Considering the abundance of CCGs, disruption of this clock mechanism may result in critical physiological problems. Hence, investigations into circadian rhythms are necessary to elucidate essential biological mechanisms and develop novel therapeutic strategies.
Luciferase reporter system 
In circadian studies, real-time monitoring is critical for a better understanding of cellular behaviors and responses because it allows tracking of temporal changes in gene expression and/or protein levels, providing insights into the molecular mechanisms regulated by the circadian clock. Furthermore, real-time monitoring enables researchers to study the effects of environmental changes on molecular mechanisms7,8. There are numerous techniques for real-time monitoring studies, including bioluminescence assay, which is widely used to track gene expression or protein levels over time. Bioluminescence assay is a method to detect biological processes using light production as a readout. In this assay, an oxidative enzyme that produces bioluminescence (e.g., luciferase) is either transiently or stably transfected into cells of interest, and the bioluminescence readout is measured in the presence of a substrate (e.g., luciferin) over time. For example, the luciferase enzyme produces bioluminescence by oxidizing the substrate luciferin in the presence of ATP9. Due to its short half-life, 3-4 h10, firefly luciferase is a powerful tool for circadian studies in terms of providing real-time dynamic monitoring with minimal background noise11,12,13. For the insertion of DNA with a luciferase-tagged promoter or open reading frame (ORF), the lentiviral gene delivery system is a reliable method that provides high transduction efficacy, stable integration, and low immunogenicity. Stable transduction of a bioluminescent reporter provides robust expression in dividing and non-dividing cells, generating consistent data for circadian studies14.
Organoid as a model 
Traditional immortalized two-dimensional cell lines have been instrumental in biological studies ranging from uncovering fundamental molecular mechanisms of circadian rhythms to drug screening. Despite the convenience of utilizing homogenized cell lines, they lack multicellular structures and intercellular interactions. In contrast, organoids are in vitro 3D multicellular &#34;organ-like&#34; structures that mimic organ structure in a dish by displaying similarity to in vivo tissue architecture and multicellularity, including stem, progenitor, and differentiated cell types15,16. Possessing self-organization, multicellularity, and functionality features makes organoids a remarkable in vitro model representing the cellular and physiological processes occurring in real tissues17. Different types of organoids can be derived from pluripotent stem cells via directed differentiation or adult stem cells harvested from various organs, including the small intestine, brain, liver, lung, and kidney18,19. Since organoid structures possess a real tissue-like architecture and function with multicellularity and dynamic cell-to-cell interaction, they are superior to homogenized cell lines for understanding the cellular events occurring in in vivo tissues. Organoids are also easily manipulated and can be grown under controlled conditions, making them useful for circadian studies20.
The main purpose of this work is to introduce a real-time monitoring method utilizing a bioluminescence assay specifically tailored for studying circadian rhythms in multicellular 3D organoids. Real-time monitoring of cellular events using a bioluminescence assay technique has been widely performed for cell cultures lacking the multicellular complexity and intercellular communications that exist in real tissues. 3D organoids present unique opportunities to investigate the functions of circadian rhythms in multicellular systems in vitro. For example, one could investigate circadian rhythms in the organoids with altered cell compositions or organoids derived from patients&#39; diseased tissues. This protocol enables the utilization of a bioluminescence assay to investigate different aspects of circadian rhythms in a more physiologically relevant in vitro model, organoids, which will help us better understand the roles of circadian rhythms in peripheral organs.

تسليط الضوء على المؤلف: التحقيقات المختبرية لإيقاعات الساعة البيولوجية في الأنظمة متعددة الخلايا

مراقبة تذبذبات الساعة البيولوجية باستخدام مراسل التلألؤ البيولوجي في المواد العضوية

Our current scope of research is to investigate the roles of circadian rhythms in intestinal epithelial cell proliferation and differentiation. We are trying to determine whether the circadian clock regulates cell proliferation and differentiation from intestinal stem cells. This protocol presents a real-time monitoring method for circadian studies in three-dimensional organoids using a bioluminescence assay.Unlike performing bioluminescence assays in a conventional two-dimensional cell culture, this approach enables us to investigate circadian rhythms and their functions in a more physiologically relevant organoid model. Our findings show disrupted circadian rhythms in stem cell-enriched conditions while demonstrating robust circadian oscillations in differentiated human intestinal organoids, suggesting a remodeling of circadian clock machinery from stem cells to differentiated cells. Usages of patient-derived organoids with circadian bioluminescent reporters will help us advance our understanding of circadian rhythms in peripheral organs and different disease states.

تم إجراء تسجيل التلألؤ البيولوجي لتقييم إيقاع الساعة البيولوجية للمعوية المعوية البشرية (HIEs) في ظل حالتين متميزتين: الظروف المخصبة بالخلايا الجذعية باستخدام وسط نمو عضوي معوي (الشكل 3) مقابل الظروف المحفزة للتمايز ، والتي تم تحقيقها عن طريق استبدال وسط نمو الأعضاء المعوية...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: In Vitro Investigations of Circadian Rhythms in Multicellular Systems at JoVE.com

تنظم إيقاعات الساعة البيولوجية ، الموجودة في معظم الكائنات الحية ، التنظيم الزمني للعمليات البيولوجية. ظهرت المواد العضوية 3D مؤخرا كنموذج ذي صلة من الناحية الفسيولوجية في المختبر . يصف هذا البروتوكول استخدام مراسلي التوهج الحيوي لمراقبة إيقاعات الساعة البيولوجية في المواد العضوية ، مما يتيح إجراء تحقيقات في المختبر لإيقاعات الساعة البيولوجية في الأنظمة متعددة الخلايا.

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse ...

يتمثل نطاق بحثنا الحالي في التحقيق في أدوار إيقاعات الساعة البيولوجية في تكاثر الخلايا الظهارية المعوية وتمايزها. نحن نحاول تحديد ما إذا كانت الساعة البيولوجية تنظم تكاثر الخلايا والتمايز عن الخلايا الجذعية المعوية. يقدم هذا البروتوكول طريقة مراقبة في الوقت الفعلي للدراسات اليومية في المواد العضوية ثلاثية الأبعاد باستخدام مقايسة التلألؤ الحيوي.على عكس إجراء فحوصات التلألؤ الحيوي في ثقافة الخلية التقليدية ثنائية الأبعاد ، يمكننا هذا النهج من التحقيق في إيقاعات الساعة البيولوجية ووظائفها في نموذج عضوي أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية. تظهر النتائج التي توصلنا إليها إيقاعات الساعة البيولوجية المضطربة في الظروف المخصبة بالخلايا الجذعية مع إظهار تذبذبات يومية قوية في عضويات معوية بشرية متمايزة ، مما يشير إلى إعادة تشكيل آلية الساعة البيولوجية من الخلايا الجذعية إلى الخلايا المتمايزة. ستساعدنا استخدامات المواد العضوية المشتقة من المريض مع مراسلي الإضاءة الحيوية اليومية على تعزيز فهمنا لإيقاعات الساعة البيولوجية في الأعضاء الطرفية وحالات المرض المختلفة.

monitoring-circadian-oscillations-with-bioluminescence-reporter

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Circadian Oscillations with a Bioluminescence Reporter in Organoids

711 Views.  University of Cincinnati College of Medicine. يتمثل نطاق بحثنا الحالي في التحقيق في أدوار إيقاعات الساعة البيولوجية في تكاثر الخلايا الظهارية المعوية وتمايزها. نحن نحاول تحديد ما إذا كانت الساعة البيولوجية تنظم تكاثر الخلايا والتمايز عن الخلايا الجذعية المعوية. يقدم هذا البروتوكول طريقة مراقبة في الوقت الفعلي للدرا...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: التحقيقات المختبرية لإيقاعات الساعة البيولوجية في الأنظمة متعددة الخلايا

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse repertoire of cellular and physiological processes ranging from sleep-wake cycles to metabolism. This clock mechanism entrains the organism based on environmental changes and coordinates the temporal regulation of molecular and physiological events. Previously, it was demonstrated that autonomous circadian rhythms are maintained even at the single-cell level using cell lines such as NIH3T3 fibroblasts, which were instrumental in uncovering the mechanisms of circadian rhythms. However, these cell lines are homogeneous cultures lacking multicellularity and robust intercellular communications. In the past decade, extensive work has been performed on the development, characterization, and application of 3D organoids, which are in vitro multicellular systems that resemble in vivo morphological structures and functions. This paper describes a protocol for detecting circadian rhythms using a bioluminescent reporter in human intestinal enteroids, which enables the investigation of circadian rhythms in multicellular systems in vitro.

Circadian rhythms, which exist in most organisms, regulate the temporal organization of biological processes. 3D organoids have recently emerged as a physiologically relevant in vitro model. This protocol describes the use of bioluminescent reporters to observe circadian rhythms in organoids, enabling in vitro investigations of circadian rhythms in multicellular systems.