Die humanen Darmenteroide wurden aus dem Labor von Dr. Michael Helmrath am Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC) gewonnen. Diese Arbeit wurde von R01 DK11005 (CIH) und der Pilotfinanzierung des University of Cincinnati Cancer Center unterstützt. Wir sind dankbar für die Unterstützung durch die Bildgebung durch das Live Microscopy Core der University of Cincinnati (NIH S10OD030402).

Alle Experimente mit humanem Gewebe zur Erzeugung von HIEs wurden von einem IRB am CCHMC genehmigt (IRB#2014-0427). In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, die in diesem Protokoll verwendet werden.
HINWEIS: Um das in diesem Protokoll beschriebene Verfahren zu veranschaulichen, haben wir Bmal1-luc humane Darmenteroide (HIEs) verwendet. Diese Enteroide durchliefen eine stabile lentivirale Transduktion22 mit dem pABpuro-BluF-Reporterplasmid, das den mit Luciferase fusionierten Bmal1-Promotor enthält, was die Aktivität des Bmal1-Promotors 21 zeigt.
1. Lentivirale Transduktion
<ol><li>Die lentivirale Transduktion22 wird unter stammzellangereicherten Bedingungen für HIEs durchgeführt. Stellen Sie insbesondere sicher, dass sich in HIEs innerhalb von 3-4 Tagen nach der Passage in das Darmwachstumsmedium Sphäroide bilden, wodurch stammzellangereicherte Bedingungen geschaffen werden.</li>
	<li>Nach der lentiviralen Transduktion22 führt man eine Antibiotikaauswahl mit 2 μg/ml Puromycin durch, gewinnt die Puromycin-resistenten HIEs zurück und passaget sie mit relativ hoher Dichte (d. h. 1 Vertiefung in 2 Vertiefungen) für 2-3x. Wenn die Wachstumsrate der HIEs langsam ist, fügen Sie dem Darmorganoid-Wachstumsmedium 10 μM ROCK-Inhibitoren (Y-27632) und 10 μM GSK-3-Inhibitoren (CHIR-99021) hinzu.</li>
</ol>2. Vorbereitung von Organoiden für den Biolumineszenz-Assay
<ol><li>Tag 1: Passage HIEs zu 35 mm runden Schalen.<ol><li>Kurz gesagt, zur Erweiterung der HIEs mischen Sie die HIEs mit einer wachstumsfaktorreduzierten (GFR) 3D-Kulturmatrix und säen Sie sie auf 24-Well-Platten mit drei Tröpfchen à 10 μl 3D-Kulturmatrix pro Well. Fügen Sie 350 μl des HIE-Wachstumsmediums hinzu und wechseln Sie es jeden zweiten Tag. HINWEIS: Die Dichte von HIE in der 3D-Kulturmatrix ist entscheidend für das Wachstum von Enteroiden. Ungefähr sollte die Anzahl der Sphäroide in jedem Tröpfchen mehr als 50 überschreiten. Ist die Zahl niedrig, wird die Wachstumsrate des HIE negativ beeinflusst.</li>
		<li>Wenn die HIEs ausreichend wachsen (ca. 7 Tage nach der Nachpassage), sammeln Sie HIEs aus vier Vertiefungen in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Waschen Sie die HIEs mit dem kalten PBS mit einer Tisch-Minizentrifuge (2.000 × g) für 40 s schnelles Schleudern, um Schmutz und überschüssige 3D-Kulturmatrix per Pipette zu entfernen.</li>
		<li>Geben Sie 0,5 ml des kalten PBS in das Pellet und wenden Sie physikalische Turbulenzen an, indem Sie bis zu 10x mit einer 1-ml-Insulinspritze spritzen, um die HIEs zu dissoziieren.</li>
		<li>Schleudern Sie die dissoziierten HIEs mit einer Tisch-Minizentrifuge wie in Schritt 2.1.3 herunter und entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Legen Sie dann das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem HIE-Pellet auf Eis, um es ca. 3 Minuten lang abzukühlen.</li>
		<li>Geben Sie die GFR 3D-Kulturmatrix in das Mikrozentrifugenröhrchen und mischen Sie sie mit dem HIE-Pellet. HINWEIS: Berechnen Sie die Menge der 3D-Kulturmatrix basierend auf der Anzahl der runden 35-mm-Schalen, die für das Experiment verwendet werden. In der Regel säen wir 30 μl 3D-Kulturmatrixtröpfchen pro runder Schale.</li>
		<li>Die Mischung aus HIEs und der 3D-Kulturmatrix in der Mitte der runden 35-mm-Schale aussäen und die Schale 20 Minuten lang bei 37 °C inkubieren, um die 3D-Kulturmatrix zu verfestigen. HINWEIS: Die Dichte der Aussaat-HIEs sollte experimentell bestimmt werden. Anhand der Intensität der Biolumineszenz kann man die Anzahl der HIEs während dieses Prozesses bestimmen.</li>
		<li>Geben Sie 2 ml vorgewärmtes Darmorganoid-Wachstumsmedium in jede Schale und inkubieren Sie die Schalen in einem CO2 -Inkubator bis zum nächsten Schritt.</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 3: Initiierung der Differenzierung<ol><li>Um die Differenzierung der HIEs einzuleiten, entfernen Sie das Wachstumsmedium und fügen Sie 2 mL vorgewärmtes Differenzierungsmedium hinzu. HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für die Rezepturen des HIE-Differenzierungsmediums23.</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 4: Es ist kein zusätzlicher Prozess erforderlich.</li>
	<li>Tag 5: Ersetzen Sie das Medium der Enteroide durch 2 mL vorgewärmtes Differenzierungsmedium.</li>
	<li>Tag 6: Uhrensynchronisation und Aufzeichnung der Biolumineszenz<ol><li>Um die molekulare Uhr der Enteroide zu synchronisieren, fügen Sie 2 μl 100 μM Dexamethason (Dex) hinzu, um die Endkonzentration in jeder Schale auf 100 nM zu erhöhen, und inkubieren Sie die Schalen dann in einem CO2 -Inkubator (37 °C, 5% CO2) für 1 h24.</li>
		<li>Bereiten Sie während des Dex-Zurücksetzens das Inkubationsluminometer vor. Überprüfen Sie den CO2 - Gehalt und die Temperatur des Inkubationsluminometers und stellen Sie es auf 5 % bzw. 37 °C ein. HINWEIS: Es wird empfohlen, das Innere des Inkubationsluminometers vor und nach jedem Gebrauch der Maschine mit 70% Alkohol abzuwischen, um es steril zu halten.</li>
		<li>Nach der Taktsynchronisation füllen Sie die Enteroide mit 3 mL vorgewärmtem Differenzierungsmedium auf, das 200 μM D-Luciferin enthält. HINWEIS: Da Luciferin lichtempfindlich ist, sollte das luciferinhaltige Medium mit Folie umwickelt und in einem 37 °C heißen Bad vorgewärmt werden, bevor es auf das Gericht aufgetragen wird.</li>
		<li>Stellen Sie die Schalen in einen 8-Well-Schalentisch des Inkubationsluminometers und decken Sie den Probenschalentisch mit seinem Deckel ab. Stellen Sie zwei Befeuchterkammern mit einem feuchten Tuch oder Schwamm auf die Oberseite des Probentisches. Dies ist ein einmaliger Vorgang. HINWEIS: Nach dem Start des Experiments sollte der Deckel des Inkubationsluminometers geschlossen bleiben, bis das Experiment beendet ist. Achten Sie darauf, die Taschentücher/Schwämme ausreichend zu befeuchten.</li>
		<li>Schließen Sie den Deckel des Geräts und starten Sie das Programm zur Messung der Biolumineszenz für die gewünschte Anzahl von Tagen und die gewünschte Auflösung.<ol><li>Wählen Sie in der Software die Bedingungseinstellungen aus, indem Sie auf die Registerkarte Bedingung klicken, und passen Sie die Einstellungen in diesem Bereich an: Anzahl der Gerichte, Messzeit, Hintergrundverarbeitung und Filtertyp. HINWEIS: Für diese Demonstration haben wir alle Gerichte von A bis H ausgewählt; Standardmesszeit, die von der Software auf der Grundlage der Anzahl der Gerichte bestimmt wird; Wartezeit für die Hintergrundverarbeitung und Filtertyp F0. Da es drei Filteroptionen gibt, können drei Leuchtfarben gleichzeitig gemessen werden.</li>
			<li>Nachdem Sie alle geeigneten Einstellungen basierend auf dem Experiment eingegeben haben, speichern Sie die Einstellungen mit OK.</li>
			<li>Um mit dem Ausführen des Experiments zu beginnen, klicken Sie auf die Registerkarte Ausführen | Start-Schaltfläche (grünes Dreieckssymbol). Beobachten Sie die Daten als roh, rauschgefiltert oder trendbereinigt, indem Sie während des Ausführens von Experimenten oben auf dem Bildschirm der Software eine entsprechende Auswahl treffen. Klicken Sie auf die Registerkarten Raw, Rauschgefiltert oder Trendbereinigt , um die ausgewählten Daten zu beobachten.</li>
			<li>Beobachten Sie Signale bis zu 5 Tage lang. HINWEIS: Nach 5-tägiger Überwachung in einem inkubierenden Luminometer können die Enteroide aufgrund von Medienerschöpfung abzusterben beginnen. Um eine mögliche zirkadiane Störung während des Experiments zu vermeiden, führen wir für die Dauer des Experiments keinen Medienwechsel durch.</li>
			<li>Beenden Sie am Ende des Experiments die Ausführung, indem Sie auf die Schaltfläche Stopp (blaues quadratisches Symbol) klicken, zur Registerkarte Datei wechseln und dann auf Speichern unter klicken. Speichern Sie die Daten im Kronos-Format. Exportieren Sie die Daten in eine Tabelle im Abschnitt Datei, indem Sie auf die Option Datei klicken und dann unter Datei zur weiteren Analyse die Option Als Excel-Format exportieren auswählen.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

Optimierung der menschlichen Darmenteroide für Studien zum zirkadianen Rhythmus

<ol>
	<li>Cox, K. H., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clock+genes+and+the+transcriptional+architecture+of+the+clock+mechanism.">Circadian clock genes and the transcriptional architecture of the clock mechanism.</a> J Mol Endocrinol. 63 (4), R93-R102 (2019).</li><li>Ayyar, V. S., Sukumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms:+Influence+on+physiology,+pharmacology,+and+therapeutic+interventions.">Circadian rhythms: Influence on physiology, pharmacology, and therapeutic interventions.</a> J Pharmacokinet Pharmacodyn. 48 (3), 321-338 (2021).</li><li>Reppert, S., Weaver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+circadian+timing+in+mammals.">Coordination of circadian timing in mammals.</a> Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).</li><li>Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+architecture+of+the+mammalian+circadian+clock.">Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock.</a> Nat Rev Genet. 18 (3), 164-179 (2017).</li><li>Wolff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+age-dependent+and+tissue-specific+circadian+transcriptome+in+male+mice.">Defining the age-dependent and tissue-specific circadian transcriptome in male mice.</a> Cell Rep. 42 (1), 111982 (2023).</li><li>Ruben, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+tissue-specific+rhythmically+expressed+human+genes+has+potential+applications+in+circadian+medicine.">A database of tissue-specific rhythmically expressed human genes has potential applications in circadian medicine.</a> Science Trans Med. 10 (458), 8806 (2018).</li><li>Huang, S., Lu, Q., Choi, M. H., Zhang, X., Kim, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+real-time+monitoring+of+circadian+oscillations+in+adult+mouse+brain+slices+to+study+communications+between+brain+regions.">Applying real-time monitoring of circadian oscillations in adult mouse brain slices to study communications between brain regions.</a> STAR Protoc. 2 (2), 100416 (2021).</li><li>Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+circadian+clock+oscillations+in+primary+cultures+of+mammalian+cells+using+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+strategy.">Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy.</a> BMC Biotechnol. 10 (3), (2010).</li><li>Choy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+noninvasive+fluorescent+and+bioluminescent+small+animal+optical+imaging.">Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging.</a> Biotechniques. 35 (5), 1022-1030 (2003).</li><li>Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+destabilized+firefly+luciferase+enzyme+for+measurement+of+gene+expression.">Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression.</a> Biotechniques. 29 (3), 590-598 (2000).</li><li>Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cell-autonomous+circadian+clock+rhythms+of+gene+expression+using+luciferase+bioluminescence+reporters.">Monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters.</a> J Vis Exp. (67), e4234 (2012).</li><li>Yoo, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PERIOD2::LUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues.">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).</li><li>Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+individual+fibroblasts+reveals+persistent,+independently+phased+circadian+rhythms+of+clock+gene+expression.">Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression.</a> Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).</li><li>Lee, S., Hong, C. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids/colonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology.">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li><li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment.">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> J Mol Med. 95 (7), 729-738 (2017).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Rosselot, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+and+function+of+the+circadian+clock+in+intestinal+organoids.">Ontogeny and function of the circadian clock in intestinal organoids.</a> EMBO J. 41 (2), 106973 (2021).</li><li>Corr&#242;, C., Novellasdemut, L., Li, V. S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+organoids.">A brief history of organoids.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 319 (1), C151-C165 (2020).</li><li>Brown, S. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+in+live+cells+and+animals.">Bioluminescence imaging in live cells and animals.</a> Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).</li><li>Xu, P., Elizalde, M., Masclee, A., Pierik, M., Jonkers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticosteroid+enhances+epithelial+barrier+function+in+intestinal+organoids+derived+from+patients+with+Chron's+disease.">Corticosteroid enhances epithelial barrier function in intestinal organoids derived from patients with Chron's disease.</a> J Mol Med (Berl). 99 (6), 805-815 (2021).</li><li>AlMusawi, S., Ahmed, M., Nateri, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+cell-cell+communication+and+signaling+in+the+colorectal+cancer+microenvironment.">Understanding cell-cell communication and signaling in the colorectal cancer microenvironment.</a> Clin Transll Med. 11 (2), 308 (2021).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Der Biolumineszenz-Assay bietet mehrere Vorteile für die Untersuchung des zirkadianen Rhythmus, was eine Datenerhebung aus Langzeit-Zeitverlaufsexperimenten erfordert. Erstens ermöglicht es Forschern, die Genexpression oder das Protein von Interesse zu überwachen, während sich Zellen bewegen und vermehren. Ohne unnötige Anpassungen vorzunehmen oder die Zellfunktionen zu stören, können interessierte zelluläre Ereignisse oder die Genexpression mithilfe der Biolumineszenzauslesung aufgezeichnet werden, die zuverläs...

Zirkadiane Uhr Alle Organismen, von Bakterien bis zu Säugetieren, haben eine komplexe und dynamische Beziehung zu ihrer Umwelt. Innerhalb dieser Beziehung ist die Anpassung an Umweltveränderungen entscheidend für das Überleben von Organismen. Die meisten Organismen verfügen über zirkadiane Rhythmen, die es ihnen ermöglichen, sich an Tageszyklen von etwa 24 Stunden anzupassen und ihre Funktionen zu optimieren. Die zirkadiane Uhr ist ein hierarchisches Netzwerk aus zentralen und peripheren Uhren, die zusammenarbeiten, um die physiologische Homöostase aufrechtzuerhalten und den Organismus mit den täglichen Veränderungen synchron zu halten 1,2. Bei Säugetieren empfängt die Zentral- oder Hauptuhr im suprachiasmatischen Kern (SCN) externe Signale wie Licht und leitet die Informationen über ein fortschrittliches Zusammenspiel von neuronalen und humoralen Signalwegen an die peripheren Uhrenweiter 3. Zusätzlich zur zentralen Uhr verfügen periphere Gewebe über einen eigenen zellautonomen zirkadianen Uhrmechanismus, der durch eine transkriptionell-translationale negative Rückkopplungsschleife (TTFL) aufrechterhalten wird, die gewebespezifische uhrgesteuerte Gene (CCGs) reguliert4,5. Diese molekulare Maschinerie erzeugt eine Rhythmizität von etwa 24 Stunden bei zellulären und physiologischen Ereignissen, wie z. B. Genexpressionen, Signalwegen, Immunantworten und Verdauung. Die zirkadiane Uhr ist in fast allen Säugetierzellen vorhanden, und es wurde gezeigt, dass bis zu 50 % der Expressionsmuster der Gene eine zirkadiane Rhythmizität aufweisen6. In Anbetracht der Fülle an CCGs kann eine Störung dieses Uhrwerks zu kritischen physiologischen Problemen führen. Daher sind Untersuchungen des zirkadianen Rhythmus notwendig, um wesentliche biologische Mechanismen aufzuklären und neue therapeutische Strategien zu entwickeln.
Luziferase-Reportersystem In zirkadianen Studien ist die Echtzeitüberwachung entscheidend für ein besseres Verständnis zellulärer Verhaltensweisen und Reaktionen, da sie die Verfolgung zeitlicher Veränderungen der Genexpression und/oder des Proteinspiegels ermöglicht und Einblicke in die molekularen Mechanismen liefert, die von der zirkadianen Uhr reguliert werden. Darüber hinaus ermöglicht die Echtzeitüberwachung den Forschern, die Auswirkungen von Umweltveränderungen auf molekulare Mechanismen zu untersuchen 7,8. Es gibt zahlreiche Techniken für Echtzeit-Überwachungsstudien, einschließlich des Biolumineszenz-Assays, der häufig zur Verfolgung der Genexpression oder des Proteinspiegels im Laufe der Zeit verwendet wird. Der Biolumineszenz-Assay ist eine Methode zum Nachweis biologischer Prozesse unter Verwendung der Lichterzeugung als Auslese. In diesem Assay wird ein oxidatives Enzym, das Biolumineszenz erzeugt (z. B. Luciferase), entweder vorübergehend oder stabil in die interessierenden Zellen transfiziert, und die Biolumineszenzauslesung wird in Gegenwart eines Substrats (z. B. Luciferin) über die Zeit gemessen. Zum Beispiel erzeugt das Luciferase-Enzym Biolumineszenz, indem es das Substrat Luciferin in Gegenwart von ATP9 oxidiert. Aufgrund ihrer kurzen Halbwertszeit von 3-4 h10 ist die Glühwürmchen-Luziferase ein leistungsstarkes Werkzeug für zirkadiane Studien, da sie eine dynamische Echtzeitüberwachung mit minimalem Hintergrundrauschen ermöglicht 11,12,13. Für die Insertion von DNA mit einem Luciferase-markierten Promotor oder Open Reading Frame (ORF) ist das lentivirale Gen-Delivery-System eine zuverlässige Methode, die eine hohe Transduktionswirksamkeit, eine stabile Integration und eine geringe Immunogenität bietet. Die stabile Transduktion eines biolumineszenten Reporters sorgt für eine robuste Expression in sich teilenden und nicht teilenden Zellen und liefert konsistente Daten für zirkadiane Studien14.
Organoid als Modell Traditionelle immortalisierte zweidimensionale Zelllinien waren maßgeblich an biologischen Studien beteiligt, die von der Aufdeckung grundlegender molekularer Mechanismen des zirkadianen Rhythmus bis hin zum Wirkstoffscreening reichen. Trotz der Bequemlichkeit, homogenisierte Zelllinien zu verwenden, fehlen ihnen multizelluläre Strukturen und interzelluläre Interaktionen. Im Gegensatz dazu handelt es sich bei Organoiden um multizelluläre "organähnliche" In-vitro-3D-Strukturen, die die Organstruktur in einer Schale nachahmen, indem sie Ähnlichkeit mit der in vivo-Gewebearchitektur und Vielzelligkeit aufweisen, einschließlich Stamm-, Vorläufer- und differenzierten Zelltypen15,16. Der Besitz von Selbstorganisation, Vielzelligkeit und Funktionalität macht Organoide zu einem bemerkenswerten In-vitro-Modell, das die zellulären und physiologischen Prozesse darstellt, die in realen Geweben ablaufen17. Verschiedene Arten von Organoiden können aus pluripotenten Stammzellen durch gerichtete Differenzierung oder adulten Stammzellen gewonnen werden, die aus verschiedenen Organen, einschließlich Dünndarm, Gehirn, Leber, Lunge und Niere entnommen werden,18,19. Da organoide Strukturen eine echte gewebeähnliche Architektur besitzen und mit Vielzelligkeit und dynamischer Zell-zu-Zell-Interaktion funktionieren, sind sie homogenisierten Zelllinien überlegen, um die zellulären Ereignisse in in vivo-Geweben zu verstehen. Organoide sind außerdem leicht zu manipulieren und können unter kontrollierten Bedingungen gezüchtet werden, was sie für zirkadiane Studien nützlich macht20.
Das Hauptziel dieser Arbeit ist die Einführung einer Echtzeit-Überwachungsmethode unter Verwendung eines Biolumineszenz-Assays, der speziell auf die Untersuchung des zirkadianen Rhythmus in multizellulären 3D-Organoiden zugeschnitten ist. Die Echtzeitüberwachung zellulärer Ereignisse mit einer Biolumineszenz-Assay-Technik wurde häufig für Zellkulturen durchgeführt, denen die multizelluläre Komplexität und interzelluläre Kommunikation fehlt, die in echtem Gewebe vorhanden sind. 3D-Organoide bieten einzigartige Möglichkeiten, die Funktionen des zirkadianen Rhythmus in multizellulären Systemen in vitro zu untersuchen. Man könnte zum Beispiel zirkadiane Rhythmen in den Organoiden mit veränderten Zellzusammensetzungen oder Organoiden untersuchen, die aus erkranktem Gewebe von Patienten stammen. Dieses Protokoll ermöglicht die Verwendung eines Biolumineszenz-Assays, um verschiedene Aspekte des zirkadianen Rhythmus in einem physiologisch relevanteren In-vitro-Modell , Organoiden, zu untersuchen, was uns helfen wird, die Rolle des zirkadianen Rhythmus in peripheren Organen besser zu verstehen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 x 10 Falcon tissue culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-Fine IV Insulin Syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-1Bb</td>
			<td>Mfrn: BD 329424</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>13122</td>
			<td>GSK-3 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4902-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin (potassium salt)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>14681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I Human</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor reduced (GFR) Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CB-40230C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>06010</td>
			<td>Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kronos Dio Luminometer Machine</td>
			<td>ATTO Corporation</td>
			<td>AB-2550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pABpuro-BluF reporter plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>46824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/10</td>
			<td>ROCK inhibitor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring circadian oscillations with a bioluminescence reporter in organoids

Die meisten lebenden Organismen besitzen zirkadiane Rhythmen, d. h. biologische Prozesse, die innerhalb eines Zeitraums von etwa 24 Stunden ablaufen und ein vielfältiges Repertoire an zellulären und physiologischen Prozessen regulieren, die vom Schlaf-Wach-Rhythmus bis zum Stoffwechsel reichen. Dieser Uhrmechanismus zieht den Organismus auf der Grundlage von Umweltveränderungen mit und koordiniert die zeitliche Regulation molekularer und physiologischer Ereignisse. Zuvor wurde gezeigt, dass autonome zirkadiane Rhythmen auch auf Einzelzellebene aufrechterhalten werden, indem Zelllinien wie NIH3T3-Fibroblasten verwendet werden, die maßgeblich an der Aufdeckung der Mechanismen des zirkadianen Rhythmus beteiligt waren. Bei diesen Zelllinien handelt es sich jedoch um homogene Kulturen, denen es an Vielzelligkeit und robuster interzellulärer Kommunikation mangelt. In den letzten zehn Jahren wurden umfangreiche Arbeiten zur Entwicklung, Charakterisierung und Anwendung von 3D-Organoiden durchgeführt, bei denen es sich um in vitro multizelluläre Systeme handelt, die in vivo morphologischen Strukturen und Funktionen ähneln. In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Detektion zirkadianer Rhythmen mit Hilfe eines biolumineszierenden Reporters in humanen intestinalen Enteroiden beschrieben, das die Untersuchung zirkadianer Rhythmen in multizellulären Systemen in vitro ermöglicht.

Circadian clock 
All organisms, from bacteria to mammals, have a complex and dynamic relationship with their environment. Within this relationship, adaptation to environmental changes is critical for the survival of organisms. Most organisms possess circadian rhythms that enable them to adapt and optimize their functions to diurnal cycles of approximately 24 h. The circadian clock is a hierarchical network of central and peripheral clocks that work in cooperation to maintain physiological homeostasis and keep organisms synchronized with daily changes1,2. In mammals, the central or master clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) receives external cues, such as light, and transmits the information to the peripheral clocks via an advanced interplay of neural and humoral signaling pathways3. In addition to the central clock, peripheral tissues possess their own cell-autonomous circadian clock mechanism, maintained by a transcriptional-translational negative feedback loop (TTFL) regulating tissue-specific clock-controlled genes (CCGs)4,5. This molecular machinery produces approximately 24 h rhythmicity in cellular and physiological events, such as gene expressions, signaling pathways, immune responses, and digestion. The circadian clock is present in almost all mammalian cells, and it has been demonstrated that up to 50% of the genes&#39; expression patterns exhibit circadian rhythmicity6. Considering the abundance of CCGs, disruption of this clock mechanism may result in critical physiological problems. Hence, investigations into circadian rhythms are necessary to elucidate essential biological mechanisms and develop novel therapeutic strategies.
Luciferase reporter system 
In circadian studies, real-time monitoring is critical for a better understanding of cellular behaviors and responses because it allows tracking of temporal changes in gene expression and/or protein levels, providing insights into the molecular mechanisms regulated by the circadian clock. Furthermore, real-time monitoring enables researchers to study the effects of environmental changes on molecular mechanisms7,8. There are numerous techniques for real-time monitoring studies, including bioluminescence assay, which is widely used to track gene expression or protein levels over time. Bioluminescence assay is a method to detect biological processes using light production as a readout. In this assay, an oxidative enzyme that produces bioluminescence (e.g., luciferase) is either transiently or stably transfected into cells of interest, and the bioluminescence readout is measured in the presence of a substrate (e.g., luciferin) over time. For example, the luciferase enzyme produces bioluminescence by oxidizing the substrate luciferin in the presence of ATP9. Due to its short half-life, 3-4 h10, firefly luciferase is a powerful tool for circadian studies in terms of providing real-time dynamic monitoring with minimal background noise11,12,13. For the insertion of DNA with a luciferase-tagged promoter or open reading frame (ORF), the lentiviral gene delivery system is a reliable method that provides high transduction efficacy, stable integration, and low immunogenicity. Stable transduction of a bioluminescent reporter provides robust expression in dividing and non-dividing cells, generating consistent data for circadian studies14.
Organoid as a model 
Traditional immortalized two-dimensional cell lines have been instrumental in biological studies ranging from uncovering fundamental molecular mechanisms of circadian rhythms to drug screening. Despite the convenience of utilizing homogenized cell lines, they lack multicellular structures and intercellular interactions. In contrast, organoids are in vitro 3D multicellular &#34;organ-like&#34; structures that mimic organ structure in a dish by displaying similarity to in vivo tissue architecture and multicellularity, including stem, progenitor, and differentiated cell types15,16. Possessing self-organization, multicellularity, and functionality features makes organoids a remarkable in vitro model representing the cellular and physiological processes occurring in real tissues17. Different types of organoids can be derived from pluripotent stem cells via directed differentiation or adult stem cells harvested from various organs, including the small intestine, brain, liver, lung, and kidney18,19. Since organoid structures possess a real tissue-like architecture and function with multicellularity and dynamic cell-to-cell interaction, they are superior to homogenized cell lines for understanding the cellular events occurring in in vivo tissues. Organoids are also easily manipulated and can be grown under controlled conditions, making them useful for circadian studies20.
The main purpose of this work is to introduce a real-time monitoring method utilizing a bioluminescence assay specifically tailored for studying circadian rhythms in multicellular 3D organoids. Real-time monitoring of cellular events using a bioluminescence assay technique has been widely performed for cell cultures lacking the multicellular complexity and intercellular communications that exist in real tissues. 3D organoids present unique opportunities to investigate the functions of circadian rhythms in multicellular systems in vitro. For example, one could investigate circadian rhythms in the organoids with altered cell compositions or organoids derived from patients&#39; diseased tissues. This protocol enables the utilization of a bioluminescence assay to investigate different aspects of circadian rhythms in a more physiologically relevant in vitro model, organoids, which will help us better understand the roles of circadian rhythms in peripheral organs.

Autor im Rampenlicht: In vitro Untersuchungen von zirkadianen Rhythmen in multizellulären Systemen

Überwachung zirkadianer Oszillationen mit einem Biolumineszenz-Reporter in Organoiden

Es wurde eine Biolumineszenzaufzeichnung durchgeführt, um die zirkadiane Rhythmizität von humanen Darmenteroiden (HIEs) unter zwei unterschiedlichen Bedingungen zu beurteilen: stammzellangereicherte Bedingungen unter Verwendung von Darmorganoid-Wachstumsmedium (Abbildung 3) im Vergleich zu differenzierungsinduzierenden Bedingungen, die durch den Ersatz des Darmorganoid-Wachstumsmediums durch ein Differenzierungsmedium erreicht wurden. Am Tag des Experiments synchronisierten wir die zirkadi...

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Zirkadiane Rhythmen, die in den meisten Organismen vorkommen, regulieren die zeitliche Organisation biologischer Prozesse. 3D-Organoide haben sich in jüngster Zeit als physiologisch relevantes In-vitro-Modell herauskristallisiert. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von biolumineszierenden Reportern zur Beobachtung zirkadianer Rhythmen in Organoiden, was in vitro Untersuchungen von zirkadianen Rhythmen in multizellulären Systemen ermöglicht.

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse ...

Unser derzeitiger Forschungsschwerpunkt besteht darin, die Rolle des zirkadianen Rhythmus bei der Proliferation und Differenzierung von Darmepithelzellen zu untersuchen. Wir versuchen herauszufinden, ob die zirkadiane Uhr die Zellproliferation und die Differenzierung von Darmstammzellen reguliert. Dieses Protokoll stellt eine Echtzeit-Überwachungsmethode für zirkadiane Studien an dreidimensionalen Organoiden unter Verwendung eines Biolumineszenz-Assays dar.Im Gegensatz zur Durchführung von Biolumineszenz-Assays in einer herkömmlichen zweidimensionalen Zellkultur ermöglicht uns dieser Ansatz, zirkadiane Rhythmen und ihre Funktionen in einem physiologisch relevanteren Organoid-Modell zu untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigen gestörte zirkadiane Rhythmen in stammzellangereicherten Zuständen und zeigen gleichzeitig robuste zirkadiane Oszillationen in differenzierten menschlichen Darmorganoiden, was auf eine Umgestaltung der zirkadianen Uhrmaschinerie von Stammzellen zu differenzierten Zellen hindeutet. Die Verwendung von patienteneigenen Organoiden mit zirkadianen biolumineszenten Reportern wird uns helfen, unser Verständnis der zirkadianen Rhythmen in peripheren Organen und verschiedenen Krankheitszuständen zu verbessern.

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Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Circadian Oscillations with a Bioluminescence Reporter in Organoids

788 Aufrufe.  University of Cincinnati College of Medicine. Unser derzeitiger Forschungsschwerpunkt besteht darin, die Rolle des zirkadianen Rhythmus bei der Proliferation und Differenzierung von Darmepithelzellen zu untersuchen. Wir versuchen herauszufinden, ob die zirkadiane Uhr die Zellproliferation und die Differenzierung von Darmstammzellen reguliert. Dieses Protokoll stellt eine Echtzeit-Überwachungsmethode für zirkadiane Studien an dreidimensionalen Organoiden unter Verwendung eines Biolumineszenz-Assays dar.Im Gegensatz zur Durchführ...

Serie: Autor im Rampenlicht: In vitro Untersuchungen von zirkadianen Rhythmen in multizellulären Systemen

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse repertoire of cellular and physiological processes ranging from sleep-wake cycles to metabolism. This clock mechanism entrains the organism based on environmental changes and coordinates the temporal regulation of molecular and physiological events. Previously, it was demonstrated that autonomous circadian rhythms are maintained even at the single-cell level using cell lines such as NIH3T3 fibroblasts, which were instrumental in uncovering the mechanisms of circadian rhythms. However, these cell lines are homogeneous cultures lacking multicellularity and robust intercellular communications. In the past decade, extensive work has been performed on the development, characterization, and application of 3D organoids, which are in vitro multicellular systems that resemble in vivo morphological structures and functions. This paper describes a protocol for detecting circadian rhythms using a bioluminescent reporter in human intestinal enteroids, which enables the investigation of circadian rhythms in multicellular systems in vitro.

Circadian rhythms, which exist in most organisms, regulate the temporal organization of biological processes. 3D organoids have recently emerged as a physiologically relevant in vitro model. This protocol describes the use of bioluminescent reporters to observe circadian rhythms in organoids, enabling in vitro investigations of circadian rhythms in multicellular systems.