Hiperinsulinêmico euglicêmico-Clamp in the Rat Consciente

Resumo

O grampo hiperinsulinêmico euglicêmico-é o "padrão ouro" para a avaliação da ação da insulina. A insulina é infundida a uma taxa constante estimulando a captação de glicose. A quantidade de glicose exógena infundido para combater essa queda é um indicativo de sensibilidade à insulina. Aqui, o procedimento é realizado em um rato, consciente desenfreada.

Resumo

Diabetes tipo 2 (diabetes tipo 2) está crescendo rapidamente na prevalência. Caracterizada por uma produção inadequada de insulina ou a incapacidade de utilizar a insulina produzida, os resultados T2D em níveis elevados de glicose no sangue. O "padrão-ouro" na avaliação da sensibilidade à insulina é um clamp hiperinsulinêmico euglicêmico-clamp ou insulina. Neste procedimento, a insulina é administrada a uma taxa constante, resultando em uma queda da glicose no sangue. Para manter a glicose no sangue a um nível constante, glicose exógena (D50) é infundida na circulação venosa. A quantidade de glucose injectada para manter a homeostase é indicativo de sensibilidade à insulina. Aqui, mostramos o procedimento de fixação básica na cronicamente cateterizada, rato, desenfreada consciente. Este modelo permite que o sangue a ser coletado com o mínimo de stress para o animal. Após a indução da anestesia, a incisão é feita na linha média e da artéria carótida comum esquerda e veia jugular direita são cateterizados. Cateteres inseridos são lavados com salina heparinizada, então exteriorizado e seguro. Animais são permitidos para se recuperar para 4-5 dias antes do experimento, com ganho de peso monitorados diariamente. Apenas os animais que recuperar o peso de pré-cirurgia níveis são utilizados em experiências. No dia do experimento, os ratos estejam em jejum e conectado a bombas contendo insulina e D50. Glucose linha de base é avaliada a partir da linha arterial e usou uma referência durante todo o experimento (euglicemia). Depois disso, a insulina é administrada a uma taxa constante para a circulação venosa. Para combinar com a queda da glicose no sangue, D50 é infundida. Se a taxa de infusão D50 é maior do que a taxa de absorção, um aumento da glicose irá ocorrer. Da mesma forma, se a taxa é insuficiente para atender a absorção de glicose do corpo inteiro, uma queda irá ocorrer. Titulação de glicose continua até que as leituras de glicose estáveis ​​são alcançados. Os níveis de glicose e as taxas de infusão de glicose durante este período estável são registrados e relatados. Resultados fornecem um índice de sensibilidade de todo o corpo à insulina. A técnica pode ser refinada para atender às necessidades específicas experimental. Ela é reforçada pelo uso de traçadores radioativos que podem determinar tecidos específicos de insulina estimulou a captação de glicose, bem como volume de negócios de glicose do corpo inteiro.

Protocolo

A: Cateterismo Cirúrgica da circulação arterial e venosa

Parte 1: arterial e venoso Preparação Cateter

1. Cortar 15 cm de PE-50 (diâmetro interno de 0,58 milímetros (0,023 ") x um diâmetro exterior de 0,965 milímetros (0,038"). Corte uma seção de tubo de silastic um milímetro (0,76 mm (0,030 ") de diâmetro interno x 1,65 milímetros (0,065 ") de diâmetro externo) para uso como restrição do grânulo. O talão de restrição impede o rato de retirar o cateter, uma vez que está no lugar.
2. Inserir as pontas dos micro pinças de dissecação para o lúmen do talão de restrição e gentilmente segure as pontas das pinças para além de esticar a abertura maior. Usando um outro par de pinças de dissecação micro, deslize o tubo silastic para o lúmen do talão de restrição. Fixe com cola adesiva forte (Loctite Super Glue). O talão deve ficar na posição horizontal ao redor do cateter. Permitir cateter para secar (24 horas).
3. Para um rato grama 300, a linha arterial é de aproximadamente 2,7 centímetros do talão de restrição enquanto a linha de jugular é de aproximadamente 3,2 centímetros. Comprimentos cateter da restrição são ajustados por 0,5 centímetros para cada aumento de 100 g no peso corporal. Não chanfro nas bordas do cateter, pois isso pode punção do vaso durante a inserção.
4. Imediatamente antes da cirurgia, preencher as linhas com salina heparinizada (10U/ml), selo ambas as extremidades com um plug em aço inoxidável tubos e colocar em etanol (70%) para esterilizar. Ar seco antes da inserção.

Parte 2: Preparação Cirúrgica

1. Procedimentos foram aprovados pela Universidade de Calgary e Animal Care Use Comitê e respeitar Canadian Association for Laboratory Animal Ciência diretrizes para a experimentação. Os procedimentos descritos abaixo foram realizados em adultos, machos Sprague-Dawley (~ 300g). Todos os procedimentos são realizados sob isoflurano, embora seja possível a utilização de anestésicos injetáveis. Todos os procedimentos cirúrgicos são realizados assegurando técnicas assépticas. Equipamento cirúrgico, copos e salina heparinizada são esterilizados em autoclave. Luvas cirúrgicas, seringas e aplicadores de algodão esterilizado ponta são comprados do fornecedor.
2. Pesar o rato e gravar o resultado. O peso será importante no acompanhamento pós-cirúrgico de animais. Únicos animais que recuperar o peso pré-operatório os níveis devem ser utilizados para a experimentação. Anestesiar ratos (3% isoflurano) em uma caixa de anestésico. Mantenha o rato em ~ isoflurano a 2% durante a cirurgia usando um cone de nariz. Cirurgia deve ser realizada em uma área que promove a desinfecção assepsia.
3. Prepare o animal através da remoção do cabelo do sítio cirúrgico (pescoço e ombros). A máquina de cortar cabelo pequeno ou depilatórios químicos podem ser usados. Executar este procedimento em uma área separada onde a cirurgia deve ser realizada.
4. Seguro de animais para a mesa cirúrgica. Garantir animal é completamente anestesiados, verificando a presença de pé / olho reflexos. Preparar os locais cirúrgicos com um desinfectante da pele adequada (etanol 70%, seguido pelo matagal betadine seguido por etanol 70%).

Parte 3: Cirurgia

1. Faça pequenas 1 centímetro incisão vertical na linha média superior à do esterno (Pick up da pele ao longo do eixo longitudinal medial com uma pinça e cortado com tesoura ou bisturi).
2. Blunt dissecar usando micro pinças de dissecação para expor o músculo esternocleidomastóideo esquerdo. Refletir este músculo para expor cerca de um centímetro da artéria carótida esquerda. Use uma pinça de dissecação com micro artéria carótida para manter a artéria no local. Suavemente provocar off tecido conjuntivo da artéria carótida. É importante isolar o nervo vago da artéria sem danificar tanto a artéria ou nervo. Isolar a artéria, em seguida, ligadura final cefálica com fio de seda 4-0 (este será usado para manipular a artéria carótida durante a cirurgia). Nota: 4-0 devem ser esterilizados com álcool 70% antes do uso.
3. Prender o recipiente com serrilhados, micro dissecação fórceps. Punção no final ligada com um calibre 21 Adaptador Luer VENOJECT Multi-Sample. Remova o plugue de tubos de aço inoxidável e insira cuidadosamente cateter com a ajuda de um introdutor de cateter estéril para admiti-lo para dentro da artéria. Assegurar o cateter é seguro com uma pinça, parcialmente liberação micro pinças de dissecação clampeamento da artéria e continuar inserindo o cateter para o talão. Neste ponto, a ponta do cateter deve ser no arco aórtico. Tome cuidado para não liberação do cateter, a pressão do navio irá forçá-lo para fora.
4. Amarre dois 4-0 com segurança abaixo de contas e um acima e confirmar que o cateter irá amostra. Lavar o sistema com solução salina heparinizada 10U/ml. Re plug-final da externa do cateter com uma ficha de tubos de aço inoxidável.
5. Usando a mesma incisão, sem corte para expor dissecar veia jugular externa direita. Isolar cuidadosamente e ligar o final cefálica com fio de seda. Puncionar a veia com uma calibre 21 Adaptador Luer VENOJECT Multi-Sample. Remova o plugue de tubos de aço inoxidável e inserir cateter com c estérilintrodutor atheter para o talão e gravata duas suturas abaixo do talão. Amarre uma sutura terceiro talão acima e confirmar que as amostras. Nivelada com a linha venosa 10U/ml heparinizado salina. Re plug-final cateter externo com tomada de tubos de aço inoxidável.
6. Túnel de calibre 14 com agulha sob a pele sem corte e fazer a incisão nas costas entre as omoplatas. Passe o cateter através da agulha para exteriorizar-los na parte de trás do rato. Cerca de quatro centímetros da linha é visível. Corte de 0,5 centímetros Tygon Tubulação Medical S-50-HL, colocá-lo em torno de ambos os cateteres exteriorizados e seguro com uma fita como requerido (azul para a veia, vermelho para artéria). Reteste cateteres para assegurar a permeabilidade, lavar e encher com solução salina heparinizada 150U/ml para prevenir a coagulação.
7. Feche todas as incisões com fio de seda 3-0. Ratos propensos lugar, em pré-aquecido gaiola, limpa com comida no fundo da gaiola.

B: Cuidados Pós-Operatórios

Parte 1: Cuidados pós-operatório imediato e Monitoramento

1. Quando o rato recupera capacidade ambulatorial completa e alerta devolver o rato para alojamento dos animais.
2. Permitir o rato para recuperar para 3-5 dias.
3. Monitorar diariamente para infecção, dor e alterações no peso. A infecção pode ser motivo de preocupação se a descarga de sites da incisão, letargia geral e / ou dor é observado. A dor é indicado por postura encurvada, pele volta babados e ausência de comportamento ambulatorial e / ou comer. A perda de peso pode ser experimentado imediatamente após a cirurgia até três dias após a cirurgia, no entanto, o peso deverá estabilizar e / ou aumento de até 10% do peso pré-cirúrgico dentro de 5 dias. Severa perda de peso pode indicar acidente vascular cerebral, infecção e / ou dor.
4. Reteste cateteres diariamente para garantir a permeabilidade.

Parte 2: Manter permeabilidade do cateter

1. A cada dia durante o pós-operatório de recuperação, preencha Seringas Dica 1ml SLIP com salina heparinizada 150U/ml e tampá-lo com uma agulha de calibre 22 sem corte. A agulha é inserida blunt 20cm de tubo PE-50 com 23 tubos de engate gauge de aço inoxidável na outra extremidade.
2. Remover bolhas de ar, colocando a extremidade com o acoplador de tubos maior do que o resto da seringa de 1ml e empurrar as bolhas para fora da linha.
3. Grampo fora da linha arterial exteriorizada a partir do rato com hemostats logo abaixo a ficha.
4. Remova o plugue de cateter de aço usando o segundo par de hemostats.
5. Insira o acoplador de tubos ligados à seringa na linha arterial e solte o hemostats oclusão do cateter exteriorizada arterial.
6. Aspirar o sangue arterial do cateter para a seringa. Se o cateter não chamar a facilidade com que pode ser necessário muito gentilmente empurrar uma pequena quantidade de solução de descarga através do cateter para desalojar a ponta do cateter no caso, é prensada contra a parede do vaso. O cateter foi completamente apagado quando o sangue chega a seringa.
7. Prender a próxima PE-50 tubulação para a seringa de 1ml e descarte da seringa. Substituir por uma nova seringa preenchida com soro fisiológico 150U/ml fresco heparinizado. Unclamp a tubulação e segurando a seringa na posição vertical novos, flick a nova seringa com o dedo para retirar eventuais bolhas de ar novo para cima e para longe da linha. Nota: Cuidado deve ser assegurada como bolhas de ar podem causar um derrame.
8. Injetar o soro fisiológico 150U/ml heparinzed até a linha de cateter é clara e livre de sangue.
9. Grampo fora da linha arterial exteriorizada a partir do rato com hemostats logo abaixo do acoplador tubulação. Remova o conector da seringa partir da linha de cateter arterial e substituí-la com a ficha de aço inoxidável da tubulação.
10. Solte o hemostats oclusão do cateter exteriorizada arterial.
11. Repita o procedimento para linha venosa. No entanto, devido a amostragem de baixa pressão venosa muitas vezes não é possível. Se a solução salina 150U/ml heparinzed pode ser infundido com resistência mínima é provável que o cateter está bem posicionado na veia.

C: hiperinsulinêmico euglicêmico-Grampo

Parte 1: Pinça de Set-up e Preparação

1. Pesar o rato e registrar o peso. Esta será necessária para determinar as taxas de infusão de insulina e glicose. Rápido o rato por pelo menos 5h antes de experimentar. Isso garante que o animal está em um estado pós-prandial ea contribuição de glicose a partir de fontes alimentares é minimizado. Coloque o rato em um pequeno recipiente / gaiola com roupa de cama, que limita o movimento excessivo. O animal deve ser capaz de virar-se eo noivo livremente.
2. Criar linhas e bombas de infusão, como visto na Figura 1. P50 comprimentos de mangueira de ligação são as seguintes: seringa para Y conector é de 8 cm, Y conector para rato é 15cm, linha arterial é 20cm, e linha venosa é 10 centímetros de comprimento. Remova os bujões de tubos de aço inoxidável e lave as linhas arterial e jugular para garantir a infusão e amostragem, respectivamente, com solução salina heparinizada 10U/ml.
3. Determinar à insulina volume necessário. Isso vai variar dependendo do nível de insulina e peso do rato. Aqui, 4mU/kg/min é administrada a uma taxa de 2uL/min. Esta é uma alta dose fisiológica. Sempre que possível, devem ser feitas tentativas para limitar o volume de infusão. Insulina deve ser adequadamente diluída e ser administrada na presença de plasma. Uma solução a 3% do plasma de rato em solução salina é utilizada para diluir a insulina neste laboratório. A insulina é HumulinR 100U/ml (Eli Lily), embora insulina de acção rápida outras podem ser empregadas. Certifique-se de insulina diluída é bem misturado antes de colocar em seringa de infusão.
4. Prepare dextrose 50%. Isto pode ser colocado diretamente em seringa na bomba de infusão. Mark bomba com "glicose" para evitar futuras confusões. Lembre-se de garantir volumes suficientes de insulina e glicose para o estudo. Grampos geralmente duram ~ 2h. No presente protocolo, seringas de 3 ml são usados.
5. Glucose lugar e seringas de insulina em Harvard Apparatus modelo 11 Plus bombas de seringa. Glucose avançar para Y Conector de linha e com uma pinça hemostática. Insulina avançar para animal, clamp linha com hemostat. Grampo linhas e permitem rato para relaxar por 30min antes de iniciar o experimento. NOTA: guardas ponta hemostat são sugeridas para evitar permanente cravação das linhas.
6. Prepare centrífuga e EDTA-tubos revestidos para a coleta de plasma. No presente estudo, amostras de sangue adicionais serão obtidos quando o animal está preso.

Parte 2: Protocolo Experimental

1. Uma amostra de insulina basal e amostra de hematócrito devem ser adquiridos. Amostragem hematócrito garante volume de sangue é mantida durante todo o experimento. Geralmente, os níveis de hematócrito não devem cair mais de 10% do valor inicial.
2. Obter uma amostra de glicose basal (One Touch Ultra, LifeScan, Inc.) e determinar o nível de glicose no sangue total a ser clipado. Aqui, nós braçadeira em euglicemia, ou 5,0 5,5 mM (Figura 2). Depois de cada amostra de sangue, lave linha arterial com um pequeno volume de solução salina heparinizada 10U/ml para prevenir a coagulação. NOTA: Certifique-se sem coágulos ou bolhas de ar estão na linha antes da infusão. Estes podem dar o animal de um derrame.
3. Iniciar infusão de insulina. Tomar glicose no sangue em intervalos de 5-10min, o monitoramento de glicose em cada momento. Ajustar a taxa de glicose de infusão conforme necessário até que um estado de equilíbrio é alcançado. Este processo é geralmente um processo de tentativa e erro e pode levar 30min a> 2h. Os níveis de glicose necessária para manter a glicemia são dependentes do protocolo experimental, as espécies e as condições atuais (Figura 2).
4. Os níveis de glicose no estado estacionário são três leituras consecutivas dentro de um intervalo definido. Aqui, dentro de três leituras ~ 1mM é considerado apertado (por exemplo, 4.8, 5.2, 5.6mm). Uma vez que o estado estacionário é atingido, a taxa recorde infusão de glicose necessária para manter a glicemia por um período de 30min. Durante este tempo as amostras de sangue adicionais podem ser obtidas. No mínimo, uma amostra de insulina plasmática e segunda amostra de hematócrito deve ser obtida.
5. Uma vez que grampo é concluída, os animais podem ser usadas para outros testes ou sacrificados e os tecidos coletados para análise posterior. Dependendo do animal, linhas de cateter pode ficar patente durante 5-7 dias.

D: hiperinsulinêmico euglicêmico-Resultados (insulina) Grampo

Quando realizada corretamente, o procedimento de fixação avalia a sensibilidade à insulina no estado de equilíbrio do rato. Ao apresentar os dados obtidos a partir da braçadeira, é essencial para documentar os níveis de glicose e as taxas de infusão de glicose. Os níveis de glicose estáveis ​​ao longo do tempo um curso de um mínimo de 30min (Figura 3) são indicativos de um estado estacionário. A glicose é considerado estável somente se glicose no sangue total é mantido dentro de ~ 1mm. Taxas de infusão de glicose mostram os níveis de glicose exógena necessária para manter a glicemia. Sempre que possível, estes valores devem ser mostrados como um curso de tempo ao invés de valor único, em média (Figura 4).

Outras medidas recomendadas para serem relatados são insulina plasmática e do hematócrito. A determinação do jejum e os níveis de insulina preso confirmar que a insulina foi administrada com sucesso e irá detectar eventuais diferenças de níveis entre os grupos de tratamento (Figura 5). Medidas de hematócrito no início e obter a conclusão do clamp de insulina são sugeridos (Figura 6). Isso é para garantir os níveis de hematócrito não caem mais de 5% durante o experimento e as alterações que acompanham no volume de fluxo sanguíneo e não influenciam a disponibilidade de glicose.

Figura 1. Experimental set-up. A Figura 1 mostra rato, desenfreada consciente durante o procedimento de fixação. Cateteres permitir a amostragem de sangue e infusões sem manipulação do animal. Bombas à esquerda contêm insulina e glicose.

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Figura 2. Esperados dados durante o processo de fixação. Para obter uma braçadeira em níveis basais (euglicemia, 5mM), os níveis de glicose exógena (D50) são manipulados até a linha de base ou 'grampo' é alcançada.

Figura 3. Resultados esperados plasma glucose do procedimento de fixação. Quando o animal é 'preso', de glicose no sangue é relativamente estável ao longo do tempo e os grupos experimentais.

Figura 4. Taxas de glicose Representante infusão do procedimento de fixação. A quantidade de glicose exógena necessária para manter a euglicemia difere. Isto é ilustrado com um controle (ração alimentar) e alto teor de gordura alimentados (resistentes à insulina) animais. A alta de gordura animal alimentado requer menos glucose injectada para manter a glicemia, principalmente porque ele é insensível à insulina infundida.

Figura 5. Insulina plasmática Representante do rato. A insulina plasmática durante o clamp de insulina deve ser maior do que o jejum de insulina plasmática, linha de base. Isso garante a insulina foi devidamente administrada ao animal durante o clamp de insulina.

Figura 6. Relato de hematócrito. O hematócrito inicial e hematócrito após a experiência deve ser obtida e relatada. Isso garante níveis de hematócrito não caem mais de 5% dos níveis basais decorrentes da amostragem excessiva de sangue arterial.

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Discussão

Inicialmente desenvolvido para a investigação da sensibilidade à insulina em seres humanos, o procedimento de fixação foi agora adaptada para outras espécies, incluindo ratos de laboratório e camundongos. Modelos animais de resistência à insulina investigando fornece uma ajuda significativa para a compreensão da fisiopatologia da sensibilidade à insulina e patologias associadas, bem como identificar as intervenções terapêuticas que têm valor clínico ^1,2. Vários métodos para avaliar a sensibi...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Tubos de polietileno Intramedic (PE-50)	Fisher Scientific	14-170-12B	Diâmetro interno de 0,58 milímetros (0,023 ") x diâmetro externo de 0,965 milímetros (0,038")
Dow Corning Tubing Laboratório Silastic	Fisher Scientific	11-189-15C	Diâmetro interno de 0,76 milímetros (0,030 ") x diâmetro externo de 1,65 milímetros (0,065")
Tygon S-50-HL Tubulação de Medicina	Harvard Apparatus	PY2 72-1251	Diâmetro interno de 3.2mm (0.125 ") x 4,7 milímetros de diâmetro exterior de (0,1875")
Loctite Super Glue	Grand & Toy	32237	Gel de Controle
Lâmina cirúrgica estéril	VWR	BD371610
Micro Pinça curva Dissecting	George Tiemann & Co.	160-20	x 2
Micro Pinça reta Dissecting	George Tiemann & Co.	160-15	x 2
Hemostática curva	George Tiemann & Co.	105-1135	x 2
Hemostática reta	George Tiemann & Co.	105-1130	x 2
Dica Guarda hemostat	Robbins Instruments, Inc.	15.09-2-004
Tesoura reta Cirurgia	George Tiemann & Co.	105-402
VENOJECT Multi-Sample Luer Adapter	Terumo Medical Products	810127A	21 gauge, 1 pol
Introdutor do cateter estéril	Becton Dickinson	406999
14-gauge agulha Blunt	Becton Dickinson	511310	Calibre 14, 2 pol
Sutura cirúrgica estéril	Johnson & Johnson Medical Products	1679H	Seda, tamanho 3-0
Não-esterilizadas suturas cirúrgicas	Angiotech Pharmaceuticals, Inc.	SP116	Seda, tamanho 4-0
Cotonetes de algodão	VWR	10806-005
4ply compressas de gaze	VWR	CA43845-062
Pequenos animais Clippers sem fio	Harvard Apparatus	729063
Isoflurano	Halocarbon Products Corp	IPN-45
Anestésico Carrinho	Benson Medical Industries, Inc.
Etanol 70%	Fisher Scientific	HC-1000
Betadine solução anti-séptica	Drogas ocidental Distribution Centre Ltd.	105267
Modelo 11 Plus bomba de seringa	Harvard Apparatus	702208
Tubos de aço inox Engates	Harvard Apparatus	72-4434	23 gauge, 0,3 polegadas
Tubulação de aço inoxidável Plugs	Harvard Apparatus	72-4436	23 gauge, 0,5 pol
Stainless Steel Needles Blunt	Instech Laboratories, Inc.	LS22	Calibre 22
60 Grau Y-Conectores	Peças pequenas	STCY-22-05	Calibre 22
CritSpin Centrífuga Micro-hematócrito	Iris processamento das amostras	CS12
Mini Centrífuga	Fisher Scientific	05-090-100
Micro Tubos da centrífuga	VWR	53550-778
50ml centrifugar tubos de polipropileno	VWR	89004-364
Dica 1ml Seringas de plástico deslizamento	Becton Dickinson	309602
Seringas 3ml Dica plástico Luerlok	Becton Dickinson	309585
Injeção de anticoagulante heparina	Drogas ocidental Distribution Centre Ltd.	102824	Fabricante: LEO Pharma Inc. Conc. 1000 UI
Solução EDTA	Promega Corp	V4231	0,5 M, pH 8,0
Salina	Drogas ocidental Distribution Centre Ltd.	ABB7983154	Fabricante: Hospira Cloreto de Sódio 0,9%
Dextrose 50%	Vetoquinol	8DEX012D
Humulin-R	Eli Lilly	HI-210	100U/ml
1ml seringas de insulina	Becton Dickinson	309311
Fisherbrand Selante * Hemato-Seal	Fisher Scientific	02-678
Fisherbrand * Tubos capilares de microhematócrito	Fisher Scientific	22-362-574
One Touch Ultra tiras de teste	LifeScan, Inc.	AW 085-314H
One Touch Ultra medidor de glicose do sangue	LifeScan, Inc.	AW 085-314.oB
Sódio Pentobarbitol	Ceva Sante Animale	1715 138	Conc. 54.7mg/ml
Red Tape Labeling Laboratório	VWR	89097-932
Fita azul Etiquetagem de Laboratório	VWR	89097-936
Pesar Escala	Fisher Scientific	01-913-88
Vórtice	VWR	58815-234
Cronômetro	VWR	62344-641