Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico

Resumo

Um protocolo rápido, simples e de baixo custo para a geração de doador-derivado multivirus específico CTLs (rctl) para infusão de células-tronco hematopoéticas alogênico transplante (TCTH) destinatários em risco de desenvolver infecções CMV, EBV ou Adv. Este processo de fabricação é compatível com GMP e deve garantir a mais ampla implementação de T-cell imunoterapia além de centros especializados.

Resumo

Infecções virais causar morbidade e mortalidade em transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico (TCTH) destinatários. Nós e os outros têm gerado com sucesso e infundida células T específicas para Epstein Barr (EBV), citomegalovírus (CMV) e adenovírus (Adv), utilizando monócitos e células EBV-transformadas linfoblastóides (EBV-LCL) gene modificado com um vetor de adenovírus como células apresentadoras de antígenos (APCs). Sómente 2x10 ⁵ / kg trivirus específicos linfócitos T citotóxicos (CTL) proliferaram por vários registros após a infusão e apareceu para prevenir e tratar a doença viral grave ainda resistentes a outras terapias disponíveis. Quanto mais ampla a implementação desta abordagem é limitada pela encorajando altos custos de produção, a complexidade de produção e tempo prolongado (4-6 semanas para EBV-LCL geração, e 4-8 semanas para a fabricação de CTL - total 10-14 semanas) para a preparação. Para superar essas limitações, temos desenvolvido um novo protocolo de GMP-compliant produção CTL. Em primeiro lugar, no lugar de adenovectors para estimular as células T que usamos células dendríticas (DCs) nucleofected com DNA de codificação de plasmídeos LMP2, EBNA1 e BZLF1 (EBV), hexon e Penton (Adv), e pp65 e IE1 (CMV), como apresentadoras de antígenos células. Estes APCs reativar células T específicas para todos os antígenos estimulante. Cultura, segundo células T ativadas na presença de IL-4 (1000 U / ml) e IL-7 (10ng/ml) aumenta e sustenta o repertório ea freqüência de células T específicas em nossas linhas. Terceiro, temos utilizado um novo dispositivo de cultura de gás permeável (G-Rex), que promove a expansão ea sobrevivência de números de grandes células, após um estímulo único, eliminando assim a necessidade de EBV-LCLS e reduzindo a intervenção do técnico. Ao implementar essas mudanças nós podemos agora produzir CTL multiespecífico segmentação EBV, CMV, e Adv, a um custo por 10 ⁶ células que é reduzida em> 90%, e em apenas 10 dias em vez de 10 semanas, utilizando uma abordagem que pode ser alargado a mais proteção antígenos virais. Nossa abordagem FDA-approved deve ser de valor para aplicações profiláticas e de tratamento para os destinatários de alto risco HSCT alogênico.

Protocolo

1. Nucleofection DC

1. Colheita derivados de monócitos DCs, que foram enriquecidas com a adesão de plástico, cultivadas por cinco dias usando celular Genix Mídia suplementado com IL4 (1000U/ml), GMCSF (800IU/ml) e ainda venceu por 24 horas usando a maturação citocinas IL4 DC (1000U / ml), GMCSF (800IU/ml), IL6100ng/ml, TNF-α 10ng/ml, IL1-β 10ng/ml e PGE2 (1μg/ml) ^1, pela ressuspensão gentil com uma pipeta de 3 ml.
2. Contar DCs viável usando azul de tripano, transferência para tubos 15ml 3x com nada menos que 0.5x10 ⁶ e não mais do que 2x10 ⁶ células / tubo.
3. Centrífuga DCs para 10mins @ 200g. Durante este período pré-aquecer celular Genix meio suplementado com as citocinas maturação DC (DC meios de maturação) - 2ml/well em três poços de uma cultura de tecidos de 12 bem tratado em uma placa de 37 ° C / 5% CO ₂ incubadora.
4. Uma vez que células terminar spinning, aspirar o sobrenadante e adicionar os plasmídeos DNA relevantes para cada um dos tubos em uma concentração final de DNA 5μg / tubo. Neste caso, adicione o plasmídeo IE1-pp65 ao tubo n º 1, hexon-Penton ao tubo # 2, e EBNA1-LMP2-BZLF1 ao tubo n º 3.
5. Ressuspender DCs e DNA com 100μl de solução Amaxa nucloefection, misture bem e transferir para o cubetas nucleofection.
6. Cubetas lugar no nucleofector 4D, escolher programa CB150 (Amaxa / Lonza), e pressione o começo.
7. Imediatamente após nucleofection adicionar 500μl do 2ml pré-aquecido celular Genix meio de maturação DC para a cubeta, misturar suavemente por pipetagem cima e para baixo 2-3 vezes, e DCs nucleofected transferência para a chapa 12 bem preparados contendo os 1,5 ml restantes de pré-aquecida maturação media DC. Transferência para a 37 ° C / 5% CO ₂ incubadora por mais 12-18hrs.

2. Estimulação das células T

1. Colheita e contagem de DCs nucleofected, e irradiar a 30Gy. Lavar uma vez com 10ml de meio de CTL (45% RPMI, Cliques 45% EHAA, 10% FBS, 2mM Glutamax) e @ 3 ressuspender x 10 ⁵ DCs por ml de mídia CTL.
2. Piscina um mínimo de 7.5x10 ⁵ (2,5 ml) e um máximo de 15x10 ⁵ (5ml) de DCs contendo cada um dos plasmídeos e transferir os DCs agrupados ao dispositivo G-Rex, que será então colocado na incubadora.
3. Para a preparação de células de resposta usar PBMCs anteriormente congelados ou não aderente células mononucleares que permanecem após a seleção DC (adesão ou CD14 seleção). Descongelar as células, a transferência para meio de cultura pré-aquecida, lave uma vez com a mídia CTL. Ressuspender as células em Media CTL, a contagem das células e levá-los a uma concentração de 2x10 ⁶ células por ml. Leve 15x10 ⁶ células ou 7.5ml e suplementar com 30000U IL4 (1000U/ml -. Conc final) e 300ng IL7 (10ng/ml - conc final.).
4. Transferência 7.5ml de PBMC (15x10 ⁶ células) para o G-Rex e superior até o biorreator com a mídia CTL para um volume total de 30ml.
5. Cultura do G-Rex por 6-7 dias a 37 ° C / 5% CO ₂ incubadora umidificada.

3. T expansão celular

1. No dia 07/06, aspirar 10ml de mídia, então misturar as células do 20ml restantes de mídia com uma pipeta de 10 ml e contagem de células viáveis ​​com azul de tripano. Se houver <50x10 ⁶ repor com novas mídias + citocinas. Se houver> 50x10 ⁶ células remover 10ml de suspensão celular, a transferência para um novo G-Rex, e depois alimentar tanto G-Rexs com novas mídias CTL + citocinas.
2. Cultura para um adicional de 4-6 dias. Uma vez que células suficientes foram ampliados, realizar uma caracterização fenotípica e funcional do excesso de CTL e criopreservar para uso futuro.

4. Resultados representativos:

Um esquema de nosso FDA-approved processo de geração de multivirus específicas CTL é mostrado na Figura 1. Em contraste com protocolos convenção multivirus CTL que usam adenovectors e EBV-LCL para estimular as células-vírus reativa T ² temos substituído material de vírus infeccioso com plasmídeos DNA que codificam antígenos derivados de cada um dos ^três vírus. Para estimular a CTL trivirus nós projetamos três multicistronic plasmídeos codificando hexon e Penton de adenovírus, IE1 e pp65 do CMV, e EBNA1, LMP2, e BZLF1 de EBV. Estes antígenos foram escolhidos com base em resultados encorajadores clínica de nossas próprias e de outros grupos mostrando que as células T dirigidos contra Adv-hexon e Penton ^2,4-6, e CMV-1E1 e CMV pp65-são protetores in vivo ^7. Para EBV, EBNA1 é um CD4 + T imunodominantes antígeno alvo celular expressa em todas as neoplasias malignas associadas ao EBV e em células normais infectadas pelo EBV B ^8,9, LMP2 é imunogênica em vários tipos de HLA múltiplas e expressa na maioria dos tumores malignos EBV, ^10,11 enquanto BZLF1 codifica uma imunodominantes, antígeno precoce imediato ciclo lítico que estimula tanto CD4 + e CD8 + T da maioria dos indivíduos e é provável que importantes para o control de células replicação do vírus ^12. Para otimizar ainda mais os nossos métodos de fabricação que colaborou com Tecnologia Nature que gerou minimizado, sem antibiótico (FDA-compliant) plasmídeos para a estimulação CTL ^13,14. Usando esta estratégia que consistentemente alcançar eficiências nucleofection de> 35%, mantendo a viabilidade das células de alta (dados não mostrados) ^3. A Figura 2 mostra que a freqüência de células T-vírus específico em resposta a cosmídeos otimizado medida pelo IFNγ ELISPOT, foi maior que em resposta a convencional plasmídeos pShuttle baseado expressão expressando os mesmos antígenos (n = 8 Adenovirus, n = 4 CMV e EBV n = 2). O melhor rácio de DC: PBMC foi importante para a estimulação das células T potente como mostrado na Figura 3, onde uma proporção de 1:50 produzidos sub-ótimo de ativação em comparação com um S 1:20: R ratio (n = 2 doadores). Produção de suficientes números CTL com a especificidade do antígeno larga é um pré-requisito para a eficácia clínica contra os três vírus. Isto é conseguido pela cultura CTL no G-Rex, que apóia a expansão de células T superiores quando comparados com os placas de 24 poços (Figura 4A) ^15, enquanto a adição de IL4 e IL7 a aumentos culturas do repertório e especificidade, como mostrado na Figura 4B onde a freqüência de células T reativas contra o CMV-pp65 derivados HLA-A2 RESTRIÇÕES NLV peptídeo foi avaliada em culturas gerado na presença ou ausência de IL4 e / ou IL7 ^16,17. Para avaliar a capacidade fenótipo e funcional das células expandidas realizamos análise de citometria de fluxo, intracelular de citocinas coloração / IFNγ ELISPOT, e ⁵¹ testes de liberação de Cr sobre o produto final para a criopreservação / perfusão. Normalmente as células geradas são policlonais com uma população mista de células CD4 + e CD8 + T com antígeno especificidade detectáveis ​​nos dois compartimentos da célula T. O CTL são capazes de matar antígeno viral expressando as células-alvo, mas não do vírus negativos parcialmente HLA alvos combinados, indicando que eles não devem induzir enxerto-versus-hospedeiro (GVHD) in vivo (Figura 5).

Figura 1. Rctl protocolo geração. Primeiro, DCs são nucleofected com o antígeno viral codificação de plasmídeos e então misturado com PBMCs autólogo em um R: S de 10 ou 20:1. Células são expandidas no G-Rex por 10-14 dias, na presença de IL4 e IL7, então colhidos, contados, testado para a identidade de função, e esterilidade, e depois criopreservados para uso clínico.

Figura 2. Cosmídeos Optimized induzem ativação de células T in vitro superiores. DCs foram nucleofected com otimizado, FDA-compliant plasmídeos codificando hexon e Penton (Adv), IE1 e pp65 (CMV), e EBNA1, LMP2, e BZLF1 (EBV) ou plasmídeos pShuttle convencionais de codificação os mesmos antígenos. Estes foram usados ​​para estimular as células T e especificidade foi analisada pelo IFNγ ELISPOT 10 dias pós-estimulação.

Figura 3 DC ideal:. Proporções de células T para a ativação do CTL. DCs de 2 doadores foram nucleofected com todos os três plasmídeos otimizado e, em seguida, utilizado para estimular PBMCs autólogo em 1:20 ou 1:50 DC: relação de PBMC. A freqüência de células T reativada foi avaliada no dia 10 de IFNγ ELISPOT.

Figura 4. Expansão de células T no G-Rex usando citocinas melhorando. Um painel mostra o dispositivo G-Rex, bem como aparência CTL na membrana gás permeável, avaliados por microscopia. Uma comparação entre a saída de células alcançado na convenção de cultura de tecidos tratados placas vs G-Rex também é mostrada. Painel B mostra a freqüência de CMV CTL pentâmero positivos alcançados nas culturas expandiu na presença de nenhum de citocinas, IL4 sozinho, IL7 sozinho e IL4 + IL7.

Figura 5. Fenótipo e função de CTL expandida. Um painel mostra um exemplo representativo do fenótipo do CTL multivirus expandido, que são policlonais com uma mistura de CD4 + (45% - helper) e CD8 + (42% - citotóxicos), as células T, dos quais a maioria (95%) expressou o memória marcador CD45RO + / CD62L + Panel. B mostra que essas células são específicos para todos os antígenos estimulante e são polifuncionais, avaliada pela coloração de citocinas intracelulares para detectar a produção de IFNΓ e TNFa após a estimulação antigênica. Painel C mostra que a CTL expandida são funcionais medida por Cr ensaio ^51. Autólogo LCL, sozinho ou transduzidas com um vetor nulo ou um vetor adenoviral expressando-CMV pp65 foram usados ​​como alcatrãofica. Alloreactivity foi avaliada através explosões alogênico PHA como um alvo.

Discussão

Infecções virais são responsáveis ​​por significativa morbidade e mortalidade em pacientes que são imunocomprometidos por sua doença ou seu tratamento. Após o transplante, por exemplo, infecções causadas por herpesvírus persistentes, como EBV e CMV, bem como por vírus respiratórios, tais como Vírus Sincicial Respiratório (VSR), são bem conhecidos, enquanto a importância de infecções causadas por Adv, vírus BK, e humanos herpesvirus (HHV) -6 tem mais recentemente sido apreciado. Enquanto agentes farmacológicos são a terapia padrão para algumas infecções, eles têm toxicidade substancial, gerar variantes resistentes, e são frequentemente ineficazes. Em contraste, as células T-vírus específicos derivados de doadores de células-tronco se mostraram seguros e eficazes para a prevenção e tratamento da infecção viral ou doença no transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH) definição ^2,5,6,18-21. No entanto, a mais ampla implementação de T imunoterapia celular é finalmente limitado pelo custo, complexidade e tempo necessário para a produção de CTL.

Nosso romance e uma abordagem rápida para gerar multivirus CTL, descrito no manuscrito atual, deve aumentar substancialmente a possibilidade de terapia com células T citotóxicas para doenças virais, permitindo que a estratégia para se tornar um padrão de atendimento para o hospedeiro imunocomprometido. O uso de plasmídeos DCs nucleofected como APCs permite apresentação de antígenos em ambos MHC classe I e II sem a concorrência de vetores virais ou mesmo de vários antígenos virais sendo expresso em uma única célula desde diferentes populações DC são utilizados para cada ^três plasmídeo. O uso de IL-4 / 7 aumenta a sobrevida das células T e proliferação, o que ajuda a aumentar correspondentemente a freqüência eo repertório de responder células T antígeno-específicos ^16,17. Finalmente, a cultura no G-Rex reduz drasticamente a apoptose de células T durante a cultura. Troca gasosa (O ₂ e CO ₂₎ ocorre através de uma membrana de silício de gás permeáveis ​​na base do frasco, evitando a hipóxia, permitindo uma maior profundidade de médio acima das células, fornecendo mais nutrientes e diluição de resíduos. Esta plataforma também pode ser estendido aos vírus adicionais como quando antígenos protetores são identificados.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
CellGenix	CellGenix	2005
IL4	R + D Systems	204-IL/CF
IL7	Peprotech	200-15
Hyclone RPMI 1640	Thermo Scientific	SH30096.01
AB soro humano	Vale Biomedical Inc.	HP1022
Nucleofector	Amaxa / Lonza	AAF-1001B & AAF-1001X
Kit Nucleofection	Amaxa / Lonza	V4XP-3012
Plasmídeos	NTC	n / a
GM-CSF	R & D	215-GM/CF
IL1	R & D	LB-201-025
IL6	R & D	206-IL-CF
TNFa	R & D	210-TA-010
PGE2	Sigma	P6532-1MG
G-Rex	Wilson Lobo Manufacturing	AY11-00027