Генерация Multivirus конкретным Т-клеток по предотвращению / лечения вирусных инфекций после аллогенной трансплантации стволовых клеток

Резюме

Быстрый, простой и экономически эффективный протокол для поколения доноров полученных multivirus конкретных ЦТЛ (rCTL) для инфузий в аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) получателей риск развития ЦМВ, Adv или EBV инфекции. Этот производственный процесс GMP-совместимый и должны обеспечить более широкую реализацию Т-клеточной иммунотерапии за пределы специализированных центрах.

Аннотация

Вирусные инфекции вызывают заболеваемость и смертность в аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) получателей. Мы и другие успешно создан и придают T-клетки, специфические для Эпштейна Барр (ВЭБ), цитомегаловирус (ЦМВ) и аденовирус (Adv) с помощью моноцитов и EBV-преобразовано лимфобластоидных клетки (EBV-LCL) генно-модифицированных с аденовирусом вектор антиген представляющих клеток (БТР). Каких-то 2х10 ⁵ / кг trivirus-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) распространились на несколько журналов после инфузии и, казалось, для профилактики и лечения даже тяжелых вирусных заболеваний, устойчивых к другим доступных методов лечения. Более полно выполнить этот обнадеживающий подход ограничен высокими издержками производства, сложности изготовления и длительного времени (4-6 недели EBV-LCL поколения, и 4-8 недель для CTL производства - всего 10-14 недели) для подготовки. Для преодоления этих ограничений мы разработали новые, GMP-совместимый протокол CTL производства. Во-первых, вместо adenovectors стимулировать Т-клеток, мы используем дендритные клетки (ДК) nucleofected с ДНК плазмиды кодирования LMP2, EBNA1 и BZLF1 (ВЭБ), Hexon и Пентон (Adv), и РР65 и IE1 (ЦМВ) в качестве антиген-представляющих клеток. Эти бронетранспортеры активировать Т-клетки, специфичные для всех стимулирующих антигенов. Во-вторых, культура активированных Т-клеток в присутствии ИЛ-4 (1,000 ед / мл) и IL-7 (10ng/ml) увеличивает и поддерживает репертуар и частота специфических Т клеток в наших линиях. В-третьих, мы использовали новые, газопроницаемых устройство культуры (G-REX), что способствует расширению и выживания большого количества клеток после однократного стимуляция, тем самым устраняя потребность в ВЭБ-LCLS и сокращения техник вмешательства. За счет внедрения этих изменений мы можем теперь производить multispecific CTL ориентации EBV, CMV, и Adv по цене на 10 ⁶ клеток, уменьшается на> 90%, а всего за 10 дней, а не 10 недель, используя подход, который может быть распространен на дополнительные защитные вирусных антигенов. Наши FDA утвержденных подход должен иметь значение для профилактики и лечения заявок на высокий риск аллогенных ГСК получателей.

протокол

1. DC nucleofection

1. Урожай моноцитарных контроллеры домена, которые были обогащены с использованием пластиковых приверженности, культивировали в течение 5 дней с помощью сотового Genix среде с IL4 (1000U/ml), GMCSF (800IU/ml) и далее созрел в течение 24 часов использования созревания DC цитокинов IL4 (1000U / мл), GMCSF (800IU/ml), IL6100ng/ml, TNF-α 10ng/ml, IL1-β 10ng/ml и PGE2 (1μg/ml) ^1, нежным ресуспендирования с 3 мл пипетки передачи.
2. Граф жизнеспособной контроллеры домена с использованием трипанового синий, передачи в 3-кратным 15 мл пробирки с не менее чем 0.5x10 ⁶ и не более 2х10 ^{6 кл} / трубы.
3. Центрифуга для РС 10mins @ 200г. За это время предварительно теплой сотовый Genix среде с созреванием DC цитокинов (СМИ DC созревания) - 2ml/well в трех скважинах 12-а тканевая культура рассматривается пластины в 37 ° С / 5% СО ₂ инкубатора.
4. Как только клетки закончили спиннинг, аспирация супернатант и добавить соответствующие плазмиды ДНК, чтобы каждый из трубы в конечной концентрации 5 мкг ДНК / трубы. В этом случае добавить плазмиды, кодирующей IE1-РР65 к трубе № 1, Hexon-Пентон к трубе № 2, и EBNA1-LMP2-BZLF1 к трубе № 3.
5. Ресуспендируют ДК и ДНК с 100 мкл раствора nucloefection Amaxa, хорошо перемешать и трансфер в nucleofection кювет.
6. Место в кювет 4D nucleofector, выберите программу CB150 (Amaxa / Lonza), и нажать старт.
7. Сразу же после nucleofection добавить 500 мкл в 2 мл подогретого сотовый Genix DC созревания СМИ кюветы, аккуратно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз по 2-3 раза, и передача nucleofected РС подготовлена ​​12-луночного планшета содержащих оставшиеся 1,5 мл предварительно нагретого СМИ DC созревания. Трансфер в 37 ° С / 5% СО ₂ инкубатора для дальнейшей 12-18hrs.

2. Т-клеток, стимуляция

1. Урожай и считать nucleofected контроллеры домена, и облучать на 30Gy. Вымойте раз с 10 мл среды CTL (45% RPMI, 45% кликов EHAA, 10% ЭТС, 2мм Glutamax) и ресуспендируйте @ 3 х 10 ⁵ контроллеров домена на мл CTL СМИ.
2. Бассейн минимум 7.5x10 ⁵ (2,5 мл) и максимум 15x10 ⁵ (5 мл) ДК содержащие каждый из плазмид и передача объединенных РС G-Rex устройства, которые затем будут помещены в инкубатор.
3. Для подготовки клетки ответчик использовать либо ранее замороженных МНПК или не соблюдают мононуклеарных клеток, которые остаются после выбора постоянного тока (следование или CD14 выбор). Оттепель клетки, трансфер в нагретого культуральной среде, мыть один раз с CTL СМИ. Ресуспендируют клеток в СМИ CTL, граф клеток и довести их до концентрации 2х10 ^{6 клеток} на мл. Возьмите 15x10 ^{6 ячеек} или 7.5ml и дополнения 30000U IL4 (1000U/ml -. Окончательным концом) и 300ng IL7 (10ng/ml - финальный конц.).
4. Передача 7.5ml из РВМС (15x10 ^{6 ячеек)} для G-Rex и пополнить биореактор с CTL СМИ, чтобы общий объем 30 мл.
5. Культура G-Rex в течение 6-7 дней при 37 ° С / 5% CO ₂ увлажненный инкубатора.

3. Т-клеток расширения

1. В день 6-7, 10 мл аспирата средств массовой информации, затем смешать клетки в оставшихся 20 мл среды с 10 мл пипетки и считать жизнеспособных клеток с трипановым синий. Если Есть <50x10 ⁶ пополнится свежим медиа + цитокинов. Если Есть> 50x10 ^{6 ячеек} удалить 10 мл клеточной суспензии, переезд в новый G-Rex, а затем кормить как G-Rexs со свежими CTL СМИ + цитокинов.
2. Культура для дополнительных 4-6 дней. После достаточного клетки были расширены, выполните фенотипические и функциональные характеристики CTL и cryopreserve избыток для будущего использования.

4. Представитель Результаты:

Схема нашей FDA утвержденных multivirus конкретных CTL процесса генерации показано на рисунке 1. В отличие от конвенции multivirus CTL протоколы, которые используют adenovectors и EBV-LCL, чтобы стимулировать вирус-реактивных Т-клеток, ² мы пришли на смену инфекционным материалом вируса с ДНК плазмиды , которые кодируют несколько антигенов производным от каждого из вирусов ^3. Чтобы стимулировать trivirus CTL, нами разработаны три multicistronic плазмид кодирования Hexon и Пентон аденовируса, IE1 и РР65 ЦМВ, и EBNA1, LMP2, а BZLF1 ВЭБ. Эти антигены были выбраны на основе поощрения клинические результаты наших собственных и других групп, показывающие, что Т-клетки, направленный против Adv-hexon и Пентон ^2,4-6, а также ЦМВ-1E1 и ЦМВ РР65 являются защитными в естественных условиях ^7. Для EBV, EBNA1 является иммунодоминантные CD4 + T-клетки-мишени антиген экспрессируется во всех EBV-связанных злокачественных опухолей и в нормальных ВЭБ-инфицированных клеток ^8,9, LMP2 является иммуногенной на несколько типов HLA и выражается в самых EBV злокачественных новообразований, в то время как ^10,11 BZLF1 кодирует иммунодоминантные, немедленное рано литического цикла антиген, который стимулирует CD4 + и CD8 + Т-клеток от большинства людей и, вероятно, важна для сотрудничестваntrol клеток репликация вируса ^12. Для дальнейшей оптимизации наших методов производства мы сотрудничали с природой технологий, создавшим minimalized, антибиотиков (FDA-совместимый) плазмиды для стимуляции ЦТЛ ^13,14. С помощью этой стратегии мы последовательно достичь nucleofection КПД> 35% при сохранении высокой жизнеспособности клеток (данные не представлены) ^3. Рисунок 2 показывает, что частота вирус-специфических Т-клеток в ответ на оптимизированных плазмиды ДНК, как измеряется IFNγ ELISpot, было больше, , чем в ответ на обычные pShuttle основе плазмиды экспрессии выражения же антигены (п = 8 аденовирус, п = 4 ЦМВ, и п = 2 EBV). Оптимальное соотношение DC: РВМС было важно для мощных стимуляция Т-клеток, как показано на рисунке 3, где отношение 1:50 производятся неоптимальной активации по сравнению с 1:20 S: R отношение (п = 2 доноров). Производство достаточного CTL номера с широкими специфичность антигена предпосылкой для клинической эффективностью против всех трех вирусов. Это достигается за счет CTL культуры в G-Rex, которая поддерживает превосходные Т расширение ячейки по сравнению с обычными 24-луночных планшетах (рис. 4а) ^15, в то время как добавление IL4 и IL7 к культурам увеличивает репертуар и специфичность как показано на рисунке 4В где частота Т-клеток, реактивная против ЦМВ РР65 полученных HLA-A2 resticted NLV пептид был оценен в культурах, генерируемых в присутствии или отсутствии IL4 и / или IL7 ^16,17. Для оценки фенотипа и функциональных возможностей расширен клетки мы проводим проточной цитометрии анализа внутриклеточных цитокинов окрашивания / IFNγ ELISpot и Cr ⁵¹ анализов релиз на конечный продукт для криоконсервации / в инфузии. Обычно сгенерированный клетки поликлональных со смешанным населением CD4 + и CD8 + Т-клеток с антигеном-специфичность обнаруживается в обоих отсеках Т клетки. CTL способны убить вирусный антиген-клеток, экспрессирующих цели, но не вирус отрицательный частично HLA соответствие цели, указывая, что они не должны вызывать трансплантат против хозяина (GVHD) в естественных условиях (рис. 5).

Рисунок 1. RCTL поколение протокола. Во-первых, контроллеры домена являются nucleofected с вирусного антигена кодирования плазмиды и затем смешивается с аутологичной МНПК на R: S 10 или 20:1. Клетки разлагаются в G-Rex в течение 10-14 дней в присутствии IL4 и IL7, затем собирают, считая, проверены на функции, идентичность и стерильность, а затем криоконсервированных для клинического использования.

Рисунок 2. Оптимизированная плазмид ДНК вызывают превосходной активацию Т-клеток в пробирке. Контроллеры домена были nucleofected с оптимизированной, FDA-совместимые плазмиды кодирования Hexon и Пентон (Adv), IE1 и РР65 (ЦМВ), и EBNA1, LMP2, а BZLF1 (ВЭБ) или обычные плазмиды pShuttle кодирования же антигены. Они были использованы, чтобы стимулировать Т-клетки и специфичность была проанализирована IFNγ ELISpot 10 дней после стимуляции.

Рисунок 3 Оптимальное DC:. Соотношение T ячейки для CTL активации. Контроллеры домена от 2 доноров nucleofected со всеми тремя оптимизированы плазмид, а затем используются для стимуляции аутологичных МНПК в 1:20 или 1:50 DC: РВМС отношение. Частота реактивации Т-клеток была оценена на 10 день от IFNγ ELISpot.

Рисунок 4. Т-клеток расширение G-Rex использованием повышения цитокинов. Группа показывает, G-Rex устройства, а также появление на CTL мембраны газопроницаемых, оценивали с помощью микроскопа. Сравнение между сотовыми выход, достигнутых в культуре ткани конвенции рассматриваются пластины против G-Rex также показано на рисунке. Группа B показывает частоту ЦМВ пентамера положительные CTL, достигнутые в культурах расширен в наличии не цитокинов, IL4 один, IL7 один и IL4 + IL7.

Рисунок 5. Фенотип и функции расширенного CTL. Группа показывает типичный пример фенотип расширен CTL multivirus, которые поликлональных смесью CD4 + (45% - помощник) и CD8 + (42% - цитотоксические) Т-клетки, из которых большинство (95%) выразили памяти маркер CD45RO + / CD62L +. Группа B показывает, что эти клетки являются специфическими для всех стимулирующих антигенов и полифункциональных по оценке внутриклеточного окрашивания цитокинов обнаружить производства IFNΓ и ФНО после антигена стимуляции. группы С показывает, что расширил CTL, являются действительными измеряется по ⁵¹ Cr анализа. Аутологичная LCL, либо самостоятельно, либо трансдуцированных с нулевого вектора или аденовирусного вектора выражения ЦМВ РР65 были использованы в качестве смолыполучает. Alloreactivity оценивалась с использованием аллогенных PHA взрывы в качестве мишени.

Обсуждение

Вирусные инфекции составляют существенную заболеваемости и смертности у пациентов, которые иммунитетом от своей болезни и ее лечении. После ГСК, например, инфекции, вызванные вирусом герпеса стойкие, такие как ВЭБ и ЦМВ, а также респираторные вирусы, такие как респираторно-синцитиальный вирус (RSV), хорошо известны, в то время как важность инфекций, вызванных Adv, BK вируса и человека вирус герпеса (HHV) -6 совсем недавно были оценены. Хотя фармакологические препараты являются стандартной терапией для некоторых инфекций, они имеют существенные токсичности, порождают устойчивые варианты, и часто неэффективны. Напротив, вирус-специфических Т клеток, полученных от доноров стволовых клеток оказались безопасными и эффективными для профилактики и лечения вирусной инфекции или болезни в гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) установление ^2,5,6,18-21. Тем не менее, более широкое внедрение иммунотерапии Т-клеток, в конечном счете ограничено стоимость, сложность и время, необходимое для CTL производства.

Наш новый и быстрый подход для создания multivirus CTL, описанные в текущих рукописи, должны существенно усилить возможности цитотоксических Т-клеточной терапии вирусных заболеваний, что позволяет стратегию, чтобы стать стандартом лечения ослабленным иммунитетом хозяина. Использование плазмиды nucleofected контроллеры домена, как БТР позволяет презентации антигена с обеих MHC класса I и II без конкуренции со стороны вирусных векторов или даже из нескольких вирусных антигенов выражены в одной клетке с разных популяциях постоянного тока используются для каждой плазмиды ^3. Использование Ил-4 / 7 увеличивает T выживания и пролиферации клеток, что соответственно повышает частоту и репертуар реагирования антиген-специфические Т-клетки ^16,17. Наконец, культура в G-Rex резко снижает T апоптоз клеток при культуры. Газообмен (O ₂ и СО в _{2 выхода)} происходит через кремниевые мембраны газопроницаемых в основании колбы, предотвращения гипоксии, позволяя большую глубину среды выше клеток, обеспечивая больше питательных веществ и разбавления отходы. Эта платформа также может быть распространено на дополнительные вирусов, когда защитные антигены идентифицированы.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
CellGenix	CellGenix	2005
IL4	R + D Systems	204-IL/CF
IL7	Peprotech	200-15
Hyclone RPMI 1640	Thermo Scientific	SH30096.01
Человек AB сыворотке	Долина биомедицинских Инк	HP1022
Nucleofector	Amaxa / Lonza	AAF-1001B и ААР-1001X
Nucleofection Kit	Amaxa / Lonza	V4XP-3012
Плазмиды	NTC	н /
GM-CSF	R & D	215-GM/CF
IL1	R & D	201-LB-025
IL6	R & D	206-Ил-CF
ФНО	R & D	210-TA-010
PGE2	Сигма	P6532-1мг
G-Rex	Уилсон Вольф Производство	AY11-00027