Preparação de Núcleos de tecido parafina-encaixados formalina-fixados para RNA e DNA Extraction

Resumo

Este protocolo de extracção modificado melhora RNA e DNA rendimentos provenientes de regiões mais precisamente alvo de interesse nos blocos de tecido histopatológicos.

Resumo

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

Introdução

Pesquisa com biomarcadores Genomic procura identificar correlatos moleculares que precisa e confiável reflectem o estado da doença, e fazê-lo de uma forma clinicamente útil. ¹ Desenvolvimento de biomarcador é dependente de análise retrospectiva de amostras de tecido bem anotados. amostras de tecidos doentes e normais são armazenadas tecido como fresco congelado em biobancos especializadas ou como tecido embebido em parafina (FFPET) bloqueia formalina-fixo em arquivos clínicos. O tecido fresco congelado permite a extracção de ácidos nucleicos de elevada qualidade e tem sido amplamente utilizado em estudos genómicos descoberta de biomarcadores ^2,3. No entanto, menos amostras de tecido estão disponíveis em bancos biológicos e estudando tais tecido apresenta uma tendência para as amostras maiores, categorias incomuns da doença, e pacientes atendidos em centros especializados com maiores capacidades para o tecido banco. ⁴ FFPET, em contraste, é o método de armazenamento padrão para tecidos humanos e animais doentes. Enquanto blocos FFPET m manter celularorphology, o processo de fixação ligações cruzadas outros constituintes celulares para os ácidos nucleicos. ARN e ADN com ligações cruzadas são recuperáveis, mas apenas em formas degradadas, altamente fragmentados ^5,6. No entanto, estes fragmentos de ADN e ARN são acessíveis à análise por uma variedade crescente de ensaios, incluindo a expressão de mRNA, a hipermetilação do ADN, e a sequência alvo. ^7,8 para explorar esta possibilidade na grande quantidade e variedade de FFPET disponível para investigação, existe uma necessidade de um protocolo de extracção eficiente e fiável.

Uma grande proporção de pesquisa com biomarcadores em tecidos concentra-se em câncer. Como outros tipos de tecido doente, tecido de câncer muitas vezes mostra heterogeneidade regional significativa na preservação celular e tipo de célula. Uma vez que a investigação biomarcador baseia-se na capacidade de correlacionar componentes do tecido doente com características moleculares, um passo fundamental deste processo é o de colheita precisa do tecido que é bem conservada e enriquecido para o disease em estudo. Em FFPET, duas técnicas de enriquecimento são frequentemente utilizados: captura a laser microdissecção (LCM), e secção micrótomo. LCM permite altamente focalizado de colheita de tecido e pode ser utilizado para isolar os tipos de células específicas, bem preservadas em tecidos heterogéneos. ^9,10 No entanto, LCM requer equipamento caro e é proibitivamente tempo para consumir um grande número de amostras. Micrótomo de corte é um processo mais amplamente utilizado em secções finas foram cortadas de blocos FFPET. ^11,12 secções micrótomo de corte muitas vezes incluem tecido que é heterogénea na preservação de células (por exemplo, vs necrótica bem preservada) e a composição (por exemplo, cancro vs parênquima benigna), e, portanto, pode levar à homogeneização de características moleculares melhores investigados separadamente. Assim, existe uma necessidade para um método de alto rendimento que enriquece para células de interesse. Um terceiro método, o isolamento de ácidos nucleicos a partir de núcleos de FFPET, fornece este enriquecimento, é adequado para alta atravhput protocolos, e tem sido utilizado por outros para isolar o ARN ou ADN a partir de núcleos de tecido separadas. ^7,13,14

Um certo número de protocolos publicados especificar métodos de extracção de ácidos nucleicos a partir de FFPET (Tabela 1). No entanto, os protocolos onde RNA e DNA são extraídos do mesmo tecido foram otimizados para secções de tecido do micrótomo, mas não para núcleos de tecido. ^15,16 protocolos Da mesma forma, publicados que oferecem uma maior especificidade de tecido, seja através de núcleos de tecidos ou microdissecações de slides, especifique procedimentos para a extracção do ADN, mas não ARN. ^7,17 Aqui, um protocolo optimizado para extracção dupla de ambos o ADN e ARN a partir do mesmo núcleo tecido é demonstrada. núcleos de tecido são colhidas através da inserção de tissue microarray (TMA) socos em regiões de interesse mapeadas em blocos FFPET. O mapeamento é realizado por anotar uma lâmina de microscópio com uma caneta de marcador e transferir a anotação para a superfície correspondente da FFPEBloco t (Figura 1).

Antes do trabalho que conduziu ao desenvolvimento da presente protocolo incluiu uma comparação dos vários sistemas de extracção de ácido nucleico disponíveis no comércio. Nesta comparação, as alterações aos protocolos comerciais, como descrito abaixo, desde os mais altos rendimentos de ADN e ARN e de qualidade (Selvarajah et ai., Na Prep). Núcleos de tecido são mais espessas do que as secções 5-10 micron uM tipicamente utilizados em protocolos de extracção FFPET ^{11,12,14,18 - 20,} e pode conter quantidades mais variáveis ​​de parafina. Para compensar esta situação, desparafinização foi melhorada por repetição de xileno e etanol tratamentos e através da introdução de um passo de homogeneização motorizado (Figura 1). Além disso, os tempos de digestão com proteinase K foram alongada para aumentar o rendimento de ADN. No geral, este protocolo é rentável e possibilita o estabelecimento de ligações entre as características moleculares e histopatológicos da doença em large, populações bem caracterizadas. O protocolo em sua totalidade pode ser realizada de forma confiável dentro de 2 dias, incluindo 3 horas de hands-on tempo, com pouca necessidade de equipamento especializado ou caro.

O protocolo passo-a-passo é seguir como uma versão modificada do protocolo do fabricante. ²¹ Por favor, consulte a Tabela de materiais / equipamentos de reagentes específicos, equipamentos e fabricantes.

Protocolo

1. Tissue Coring

1. Comente a lâmina de microscópio e delinear a região (s) de interesse usando um marcador permanente de ponta fina. Cortar uma seção do filme de parafina suficientemente grande para cobrir a região de interesse sobre a lâmina de microscópio. Coloque filme firmemente no slide e enrole filme sobre arestas para manter o filme de escorregar. Usando um marcador permanente de ponta fina, o contorno do tecido inteiro e região (s) de interesse dentro do tecido, mantendo o toque esboço - mas fora - a região (s).
2. Retire o filme e transferi-lo para o bloco de tecido correspondente. Orientar o filme por invertendo ou girando-a de modo que o contorno de todo o tecido observado corresponde à forma do tecido no bloco (Figura 1). Pressionar a secção de película firmemente à superfície do bloco, para impedir o escorregamento.
3. Com a ponta do marcador permanente, fazer entalhes rasos mas visíveis (~ 0,2 milímetros) ao longo do contorno da região (s) de noteresse, em seguida, retire o filme. Carga de 1 ml de lixívia, 70% de etanol, e água em 1,5 ou 2,0 ml tubos de microcentrífuga separados.
4. Limpe o perfurador receptor (vermelho) do perfurador 0,6 milímetros definir deslizando o soco para cima e para baixo várias vezes enquanto a ponta está submerso na água sanitária tubo contendo. Repetir o passo anterior com 70% de etanol e, em seguida, água (crítica para assegurar que branqueador é removido).
5. Pressionar o perfurador para dentro do tecido, no interior da região de interesse para uma profundidade de 3 mm e retirar o soco. Solte o núcleo em uma ligação de tubo de 1,5 ou 2 ml, empurrando-o para fora do soco com a caneta baixa. Armazenar os núcleos a -20 ° C (a longo prazo) ou 4 ° C para utilização a curto prazo.
6. Limpe o soco acordo com o passo 1.4 e continue com as próximas regiões ou amostra.

2. Desparafinar os núcleos de tecido FFPE

1. desparafinização Carryout em 1,5 ou tubos de 2 ml pela adição de 1 ml de xileno ao núcleo tecido e vortex vigorosamente durante 10 sec. Ele umT durante 3 min a 50 ° C.
2. Centrifugar durante 2 minutos à temperatura ambiente (RT) e a velocidade máxima (21130 xg) e o tubo de colocar em gelo durante 5 min (permite o resíduo ceroso a solidificar no topo).
3. Remova cuidadosamente a parafina acumulada em torno de menisco com sobrenadante utilizando uma ponta de pipeta e repita o tratamento xileno (passos 2,1-2,2).
4. Adicionar 1 ml de etanol (100%) e agitar vigorosamente em vórtice durante 10 seg. Centrifugar durante 2 minutos à temperatura ambiente (velocidade máxima), e rejeitar cuidadosamente o etanol. Repita o passo anterior uma vez.

3. A homogeneização dos núcleos desparafinadas

1. Ressuspender os núcleos em 700 uL de etanol (100%) antes da homogeneização. Usando um homogeneizador de tecido motorizado, moer os núcleos em partículas de tecidos finos (~ 1 min no ajuste médio). Limpe a sonda homogeneizador entre cada amostra para minimizar carry-over contaminação.
   1. Encher tubos de 15 ml com ~ 10 ml de lixívia, solução de neutralização de RNase e 70% de etanol. Após homo amostrahomoge-, lava-se a sonda homogeneizador em cada uma das soluções de limpeza, na ordem indicada acima. Executar o homogeneizador de velocidade mais elevada durante a fase de lavagem.
   2. Limpe a sonda com o tecido e permitir que sonda para secar completamente antes de homogeneizar a amostra seguinte. Inspecione visualmente as lâminas de sonda para pedaços de tecido residual. Se encontrado, limpe a sonda novamente. Mudar as soluções de limpeza (lixívia, etanol, solução de RNase e de neutralização) por dia.
2. Após homogeneização, trazer o volume da amostra de 1 ml pela adição de mais etanol a 100% (~ 300 mL). Centrifugar a uma velocidade máxima durante 15 min, aspirar cuidadosamente o etanol e o sedimento seca do ar durante aproximadamente 15-20 minutos antes de prosseguir com a extração de RNA.

4. A digestão com proteinase K

1. Ressuspender o sedimento em 150 ul de proteinase K e tampão de digestão tubo de filme para soltar o sedimento. Adicionar 10 ml de proteinase temperatura estável K e misture por um movimento súbito (nãovortex o tubo). Incubar o conteúdo do tubo, a 56 ° C durante 15 min com agitação suave.
2. Permitir tubo a incubar em gelo durante 3 min. completo arrefecimento é importante para a precipitação eficiente no passo seguinte. Centrifugar durante 15 minutos à velocidade máxima.

5. RNA separado do DNA

1. Transferir cuidadosamente o sobrenadante, sem perturbar o sedimento, para um novo 1,5 ml de purificação de ARN.
2. Manter o pellet para a purificação de DNA (pelete pode ser armazenada durante 2 h à RT, durante até 1 dia a 2-8 ° C, ou por períodos mais longos à temperatura de -20 ° C).

6. RNA Purificação

1. Incubar o sobrenadante contendo o ARN a 80 ° C durante 15 minutos (não exceder este tempo). Em seguida, o tubo de Centrifugar brevemente para recolher gotas de dentro da tampa.
2. Adicionar 320 ul de tampão RLT para ajustar as condições de ligação, e misture por pipetagem. Em seguida, adicione 720 etanol ul (100%) e vortex.
3. transferência 600 ul da amostra, incluindo qualquer precipitado que se possa ter formado, a coluna de spin de ARN (fornecido no kit) colocada num tubo de recolha de 2 ml e anular o conteúdo remanescente. Centrifugar por 15 segundos a ≥8,000 xg, descartar o flow-through e reutilizar o tubo de coleta.
4. Transferência restante amostra numa coluna, incluindo as gotículas que podem ter acumulado na tampa do tubo de centrífuga, de 15 segundos a ≥8,000 xg, e descartar o fluxo de passagem.
5. Adicionar 350 mL de buffer FRN à coluna de centrifugação e centrifugar por 15 segundos a ≥8,000 xg, descartar o flow-through e reutilizar tubo de coleta.
6. Misturar suavemente 10 ul da solução de ADNase I, com 70 ul de tampão de RDD, adicionar directamente para a membrana da coluna de spin, e incubar à TA durante 15 min.
7. Adicionar 500 ul de tampão de FRN para a coluna de centrifugação, centrifugar durante 15 segundos a ≥8,000 xg e guardar o fluxo de passagem para uso no passo seguinte. Para melhorar a recuperação de pequenos RNAs, coloque a coluna de rotação em umnovo tubo de recolha de 2 mL e aplicar o fluxo através do passo anterior para a coluna de centrifugação.
8. Centrifugar por 15 segundos a ≥8,000 xg, descartar o flow-through e reutilizar o tubo de coleta no passo seguinte. Adicionar 500 ul de tampão de RPE para a coluna de centrifugação e centrifugar durante 15 segundos a ≥8,000 xg, descartar o fluxo de passagem e reutilizar o tubo de recolha no passo seguinte.
9. Adicionar 500 ul de tampão de RPE para a coluna de centrifugação e centrifugar durante 15 segundos a ≥8,000 xg e rejeitar o tubo de recolha com o fluxo de passagem.
10. Colocar a coluna de centrifugação em um novo tubo de recolha de 2 ml, abrir a tampa e de centrifugação à velocidade máxima durante 5 min. Rejeitar o tubo de recolha com o fluxo de passagem.
11. Colocar a coluna de centrifugação numa nova recolha de 1,5 ml, adicionar 20 ul de água isenta de RNase directamente para a membrana da coluna de spin, e incuba-se o tubo durante 1 min à temperatura ambiente. Centrifugar a uma velocidade máxima durante 1 min para eluir o ARN. Armazenar a amostra de ARN eluído a -80 ° C.

7. purificação de DNA

1. Ressuspender o sedimento obtido da extracção de RNA por adição gradual de 45 ul de tampão de proteinase K (400 mM de Tris 7,5, NaCl 400 mM, _MgCl2 3 mM, 4% de SDS); 45 ul de _H2O; e 400? g de alta potência proteinase K.
2. Incubar a solução acima referida a 56 ° C durante 24 h (recomendado) ou durante a noite. Performincubation a 90 ° C durante 2 h sem agitação e centrifugar brevemente o tubo de microcentrífuga para recolher gotas de dentro da tampa.
3. Deixar a amostra arrefecer até à temperatura ambiente e, em seguida, adicionar 4 mL de RNase A (100 mg / ml). Incubar a amostra durante 2 minutos à TA.
4. Adicionar 200 ul de tampão AL à amostra, e misture bem em vórtice. Em seguida, adicione 200 mL de etanol 100% e misturar bem em vórtice. Transfira a totalidade da amostra para a coluna fornecida rotação, no lugar de um tubo de recolha de 2 ml e centrifugar durante 1 min a ≥8,000 x g.
5. Descarte o tubo de coleta com oflow-through e colocar a coluna de centrifugação em um novo tubo de recolha de 2 ml. Adicionar 700 mL de buffer AW1 à coluna de centrifugação, centrifugar por 15 segundos a ≥8,000 xg, descartar o flow-through e reutilizar o tubo de coleta.
6. Adicionar 700 mL de buffer AW2 à coluna de centrifugação, centrifugar por 15 segundos a ≥8,000 xg, descartar o flow-through e reutilizar o tubo de coleta. Em seguida, adicionar 700 ul de etanol a 100% para a coluna de centrifugação, centrifugar durante 15 segundos a ≥8,000 xg e rejeitar o tubo de recolha com o fluxo de passagem.
7. Colocar a coluna de centrifugação em um novo tubo de recolha de 2 ml, abrir a tampa da coluna de centrifugação, e centrifugação à velocidade máxima durante 5 min. Rejeitar o tubo de recolha com o fluxo de passagem.
8. Colocar a coluna de centrifugação em um novo tubo de recolha de 1,5 ml e adicionar 25 ul de água isenta de nuclease aquecida (50 ° C). Incubar coluna e o tubo a 50 ° C durante 10 min. Centrifugar durante 1 minuto à velocidade máxima, adicionar 25 ul de água isenta de nuclease (RT) para a coluna e incubar durante1 min a RT.
9. Centrifugar durante 1 minuto à velocidade máxima (21130 xg) e colheita de fluxo contendo ADN genómico (aproximadamente 50 ul de ADN total). Armazenar a coluna à temperatura de -20 ° C (no caso de outro eluição é necessária mais tarde).

Resultados

Este protocolo representa um método otimizado para a recuperação de DNA e RNA de núcleos de tecido, utilizando modificações de um sistema de extracção comercial projetado para secções de tecido. Optimização incluiu a introdução de homogeneização de tecidos, a utilização de mais potente proteinase K para a extracção do ADN, e extensão do tempo de digestão de tecido. Gráficos e análises estatísticas incluído 2-way ANOVA, regressão linear e correlação.

Otimizações de Proteinase Digestão
O kit comercial incluiu uma solução estável de proteinase K à temperatura ambiente, que foi substituído com um mais potente de proteinase K, resultando num rendimento de DNA mais elevada (Figura 2A). Para aumentar ainda mais o rendimento de ADN, digestão foi estendido de 2 a 24 horas. Não foram observadas diferenças significativas entre os dois pontos de tempo, mas a digestão 24 hr pareceu oferecer rendimentos mais consistentes em samples. No entanto, a incubação adicional de 48 horas não se melhorar ainda mais a recuperação de ADN (Figura 2B; p = 0,74).

A recuperação de DNA típica de Amostras de Tecido FFPE do cancro da próstata

Usando o protocolo optimizado, RNA e DNA foram co-extraído de amostras FFPET cancro da próstata 333 que variam de 3 a 14 anos de idade da amostra. De cada amostra, 3 núcleos de tecido (volume de tecido total médio de 0,95 ± 0,13 ^mm3) foram utilizados como entrada. Embora existam outros métodos baseados em electroforese em gel de microfluidos, que pode estimar concentrações e proporcionam avaliações da distribuição do tamanho das moléculas de ácidos nucleicos, tais métodos não fornecem reprodutível ácidos nucleicos quantificação, e não pode distinguir entre ARN e ADN como ensaios baseados em flourometrically fazer. ²² E, porque microfluídicos com base resultados de electroforese em gel não são confiáveis ​​para fragmentadaácidos nucleicos derivados de FFPET, ²³ rendimentos de ácidos nucleicos foram medidos fluorometricamente (ver lista de reagentes para detalhes). O rendimento médio foi de 2270 ng de ARN e 820 ng de ADN (Figura 3A). Aproximadamente 90% de todas as amostras FFPET analisados ​​neste estudo produziu ≥100 ng de ADN e ≥ 500 ng de ARN. Curiosamente, não houve correlação significativa entre a idade da amostra FFPET e a recuperação do ácido nucleico (Figura 3B). Em geral, os rendimentos de DNA e RNA foram correlacionados em todas as amostras (R ² = 0,39; p <0,0001), apesar de mais do que duas vezes mais ARN de ADN foi recuperado a partir de cada amostra (Figura 3C).

Enquanto o piloto e otimização trabalho foi realizado em tecidos da próstata, o próximo passo foi investigar o desempenho deste protocolo sobre alguns tipos adicionais de tecido de arquivo. Começando com cirurgicamente removidos e as amostras de autópsia FFPET ser representandofígado benignos (uma amostra a partir de um caso), cancros do cérebro (8 amostras a partir de um caso), bexiga urinária (2 amostras de 2 casos), e mama (3 amostras de 3 casos), o protocolo produziu> 100 ng de DNA e RNA a partir de 90% das amostras (Figura 3D). Enquanto os rendimentos de ácidos nucleicos foram menores em tecidos de autópsia do que em tecidos cirúrgicos, resultados representativos indicam que o protocolo produz rendimentos semelhantes em toda cancros derivados de diferentes sites.

Avaliação de RNA e DNA Integridade e seu desempenho Representante na Análise Downstream

A análise de 47 genes em 8 amostras de cancro da próstata FFPET seleccionados e um PC-3 de amostra de linha celular de cancro da próstata fresco (como um controlo positivo) expressão do RNA foi realizada utilizando uma plataforma de expressão do gene multianalitos comercial, que é optimizada para FFPET. As contagens de ARNm em PC3 foram tipicamente mais elevados do que os de sa FFPETmples (Figura 4A). No entanto, comparando a expressão relativa de todos os genes, as amostras de cancro da próstata FFPET mostrou perfis de expressão semelhantes a ARN PC-3, o que indica que ambas as fontes de ARN são adequados para o perfil de expressão de ARN.

Para demonstrar o desempenho de DNA genômico extraído com este protocolo, extratos de DNA bissulfito-convertido a partir de amostras FFPET foram amplificados por metilação PCR específico (MSP). ²⁴ A análise MSP da ALU elementos repetitivos, regiões altamente metilados presentes em milhões de cópias no genoma humano, ²⁵ foi usada como um controle de metilação do genoma, e espera-se que mostram variações mínimas entre as amostras. Como mostrado na Figura 4B, houve pouca ou nenhuma variação observada entre amostras diferentes em níveis de metilação ALU MSP. Além disso, os ensaios com base em MSP de GSTP1, um gene conhecidos a ser hipermetilado em cancro da próstata, mas não em amostras benignas, ²⁶ não mostrou nenhum amplif detectávelications no DNA a partir de amostras benignas. Tal como esperado, mais baixos valores de limiar de ciclo qPCR foram detectados em DNA de tecidos de cancro, indicando enriquecimento de cópias GSTP1 metilados. O utilitário de ácidos nucleicos recuperados por este protocolo foi adicionalmente testada em ensaios típicos a jusante, utilizando ácidos nucleicos recuperados a partir de fígado benigno e de um cérebro (post-mortem) e a partir de duas amostras de cancro da mama removidos cirurgicamente. Ambos expressão com base e MSP ensaios de RT-qPCR um bom desempenho em cancro da mama e FFPET fígado, mas o ensaio de RT-PCR não conseguiram amplificar um ARNm altamente expresso a partir da amostra de tumor cerebral post-mortem (Figura 4C), sugerindo que o RNA tinha degradado, provavelmente devido à fixação do tecido atrasado.

Figura 1:. Visão geral do processo de extracção de amostras FFPET A figura ilustra como uma área de interesse em umbloco de tecido é mapeado com base na seleção histopatológico de uma lâmina de microscópio. Três núcleos de tecido de 0,6 mm são então obtidos a partir de cada área de tecido usando socos biópsia, homogeneizada em conjunto e, em seguida, submetido a extração de RNA e DNA. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Ácidos Nucleicos (DNA e RNA) rendimentos em ng / mm ³ de FFPET de dois Proteinase K (temperatura estável e de alta potência enzimas), e testado em uma série de Incubação vezes para o último (A) Desempenho de Proteinase K. de diferentes fornecedores. extracções de ADN foram realizadas em uma amostra representativa utilizando FFPET temperatura enzima estável fornecido com o K-lo contra uma enzima mais potente de outro fabricante. (B) determinar o tempo de incubação óptimo proteinase K para maximizar o rendimento de ADN. Desempenho de alta concentração digestão com proteinase K foi avaliado em três diferentes períodos de incubação utilizando 3 amostras FFPET. As barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3:., Nucleic Acids (ADN e ARN) os rendimentos em ng / mm ³ de FFPET no total, ao longo dos anos de exemplo e tipos de tecidos representativos (A) total recuperado ácidos nucleicos a partir de tecido embebido em parafina e fixado em formalina. As quantidades de ácidos nucleicos apresentadas baseiam-se nas extracções de 333 amostras FFPET ucantar o protocolo optimizado. (B) curva de correlação entre o DNA e RNA total recuperada e a idade das amostras FFPET. As amostras FFPET extraídos utilizados foram obtidos a partir dos anos de 2000 a 2012. (C) Correlação entre os rendimentos de DNA simultaneamente extraído e RNA a partir de 333 amostras de próstata. Existe uma correlação positiva entre o DNA e RNA rendimentos. (D) Demonstração do protocolo utilizando outros tipos de tecido de arquivamento. O protocolo optimizado foi usado para extrair os ácidos nucleicos a partir de 14 de cancro (mama, da bexiga e do cérebro) e as amostras normais (fígado). As barras de erro representam SEM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Desempenho de ARN e ADN extraído de Co-Teciduale núcleos em aplicações a jusante. (A) mRNA conta para tecidos de câncer de próstata FFPE e para o controle de linha de células frescas PC-3. Cada ponto representa a média de 3 repetições técnicas extraídos separadamente. valores de ARN fresca linha de células PC-3 são ilustrados por barras amarelas e valores de tecido FFPET são representados por pontos coloridos. Os ensaios de PCR específicos (B) de metilação no DNA de amostras de cancro da próstata FFPET. valores limiares do ciclo foram obtidos para 10 amostras realizadas como esperado utilizando 50 ng / reacção de ADN convertido com bissulfito. ALU ensaios MSP de todas as amostras FFPET teve limiares ciclo semelhantes (p> 0,67). Os ensaios de MSP de GSTP1 metilação apresentaram maior (menor limiar de ciclo) níveis no cancro da próstata do que na próstata benigna. (C) Avaliação da qualidade do DNA e RNA a partir de tipos de tecidos adicionais. Os ensaios de expressão de gene de metilação do gene HPRT1 e Alu foram realizados em ácidos nucleicos (RNA e DNA, respectivamente) extraídos nemfígado mal (autópsia) e cerebrais (autópsia) e de mama (todos FFPET). Os resultados da próstata são mostrados para comparação. Nota: Foram observados resultados semelhantes a partir de cada tipo de tecido, excepto para a amplificação de ARNm de uma amostra falhou autópsia. Cada ponto ou barra representa uma amostra, e barras de erro representam SEM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Cores de tecido
	Entrada de tecido (mm3)	Extraído Ácido Nucleico	Validação		verificação de qualidade: DNA			verificação de qualidade: RNA
			(# De amostras)	Age of Sample (anos)	Rendimento total (ng)	O tamanho dos fragmentos (pb)	PCR	Rendimento total (ng)	O tamanho dos fragmentos (pb)	PCR	NanoString
Pikor et ai.	43-129	DNA	Não existem dados	Não existem dados	Não existem dados	Não existem dados
Montaser-Kouhsari et ai.	18-29,5	RNA	763	0-25				843	Não existem dados
Este papel	1,71	ADN e ARN	> 350	3-12	820	100 - 500		2270	100-500		/ftp_upload/54299/check_mark.jpg "/>
As secções de tecido
	Entrada Tissue	Extraído Ácido Nucleico	Validação		verificação de qualidade: DNA			verificação de qualidade: RNA
			(# De amostras)	Age of Sample (anos)	Rendimento total (ng)	O tamanho dos fragmentos (pb)	PCR	Rendimento total (ng)	O tamanho dos fragmentos (pb)	PCR	NanoString
Heikal et ai.	5 x 5 mm	DNA	12	7-22	88-300	103-351
Chung et ai.	1 x 20 hum	RNA	9	> 5				16.000 23.000	100-200
Antica et al.	2 x 4 mm	RNA	18	Não existem dados				Desconhecido (621 ng / mL)	80-202 +
Ghatak et ai.	5 x 5 mm	ADN e ARN	5	1	14 256	<1030		16 000	109-400 +
Hennig et ai.	1 x 10 ^ M	ADN e ARN	210	1-25	Não existem dados	Não existem dados		Não existem dados	Não existem dados
Microdissecção Captura Laser
	Entrada de tecido (mm2)	Extraído Ácido Nucleico	Validação		verificação de qualidade: DNA			verificação de qualidade: RNA
			(# De amostras)	Age of Sample (anos)	Rendimento total (ng)	O tamanho dos fragmentos (pb)	PCR	Rendimento total (ng)	O tamanho dos fragmentos (pb)	PCR	NanoString
Snow et ai.	1-2	DNA	110	0-2	430	Não existem dados

Tabela 1:. Uma comparação de protocolos de DNA e de extração de RNA publicadas para núcleos de tecidos, cortes e microdissecações captura a laser Também estão incluídos vários terminais moleculares avaliação destes métodos usando ensaios de PCR e Nanostring.

Discussão

Para a extracção bem sucedida de DNA e RNA a partir de regiões de tecido de interesse, de descaroçamento precisas é crítica. Este protocolo descreve a utilização de um punção de tecidos para isolar núcleos de 0,6 mm de diâmetro e descreve o processo de transferência de lâminas de microscópio notações para blocos FFPET correspondente. Modificações com o protocolo do fabricante foram necessária para extrair eficientemente os ácidos nucleicos a partir de núcleos, que são cerca de 50 vezes mais espessas do que as secções de micrótomo para que o protocolo foi pretendidos. Uma vez que os núcleos podem conter mais de cera de parafina em relação a cortes de tecido, desparafinização eficaz de núcleos através de passos xileno e tratamento de etanol repetidas foram necessários. O sucesso das etapas de pós-desparafinização dependia adequada mecânica núcleos de tecido homogeneização e proteinase eficiente digestão K. Além disso optimização da digestão com proteinase K pode ser realizado.

Vale ressaltar que este método identiFIES áreas de interesse sobre a superfície do bloco, tal como identificadas em lâminas de histopatologia correspondente. Como o tecido colheitas principais que podem ser de 3 ou 4 mm de profundidade, os usuários deste protocolo pode estar preocupado com o que as células ou tecidos jazia sob a superfície do bloco. Embora esta seja uma preocupação válida, vários estudos (revistos em referência ²⁷⁾ demonstraram que os núcleos de tecido representam fielmente o histológica e características moleculares dos blocos de tecido patológico, especialmente quando duplicado ou triplicado núcleos são provenientes da área de interesse.

À medida que o kit de extracção comercial modificado adoptada neste protocolo permite a extracção simultânea de DNA e RNA a partir do mesmo tecido, o protocolo economiza material biológico precioso e permite uma comparação directa entre os dois ácidos nucleicos resultantes da mesma amostra. extração simultânea de RNA e DNA reduz trabalho e tecido exaustão pela metade, e permite a análise integrada precisa de expr geneESSÃO, bem como características epigenética e genéticas encontradas no DNA. Uma vez que os teores de ambos ARN e ADN a partir destes núcleos de tecido representativo tipicamente superior a 600 e 300 ng, respectivamente, e uma vez que a maioria das aplicações de PCR e sequenciação próxima geração de correntes requerem tipicamente 10-100 ng, a maioria das amostras purificadas por este protocolo deve fornecer adequada material para vários ensaios a jusante. Este protocolo foi mostrado para ser reprodutível entre laboratórios independentes (Selvarajah et ai., Na Prep.). RNA a partir deste protocolo era de qualidade suficiente para a análise da expressão gênica usando RT-PCR ou uma plataforma multianalitos popular, e DNA bom desempenho em ensaios de PCR específicos de metilação. Futuros estudos que visam avaliar a utilidade de ácidos nucleicos recuperados em próxima geração seqüenciamento são garantidos.

Assim, várias modificações foram feitas para um protocolo disponível no mercado, projetado para seções FFPET finas, tornando-o adequado for o co-extracção de ARN e ADN de núcleos FFPET 0,6 mm. O protocolo consistentemente demonstrado altos rendimentos em um grande grupo de amostras de câncer de próstata e em um conjunto limitado de amostras de cancros da mama, do cérebro e da bexiga. No geral, o protocolo deve permitir que os utilizadores efectuem análises baseadas em genes-alvo de grandes coleções de tecidos bem anotados. É importante ressaltar que o protocolo permite eficiente de amostragem focalizado de regiões de interesse em FFPET, relativamente poucos hands-on tempo, e os rendimentos suficientemente altos para a maioria das aplicações a jusante.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic paraffin film, "Parafilm 'M'"	Bemis	RK-06720-40	Any generic paraffin film will work as a substitute
Sodium Hypochlorite, "Ultra Bleach"	Likewise	53-2879-2	Any generic bleach will work as a substitute. Hazardous material that can cause burns on contact.
Molecular biology grade absolute ethanol	Fisher BioReagents	BP2818-500	Sigma-Aldrich E7023 suffices as a substitute
Molecular Grade H2O	G-Biosciences	786-293	Sigma W4502 suffices, as well as any other brand of molecular grade H2O
0.6 mm Punch Set for Beecher Instruments	Estigen	MPO6[Yellow]	Make sure to use the red receiver punch from the set
Fine point permanent marker	Sharpie	10365796S	Using the marker on FFPE tissues causes it to dry out quickly, so several may be required
FFPE tissue block
Stained tissue slide corresponding to FFPE block
1.5 ml Micro-Centrifuge Tubes	Fisher BioReagents	05-408-137
2.0 ml Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes)	Eppendorf	22431048
1.5 ml Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes)	Eppendorf	22431021
Histology Xylene	VWR	CA 95057-822	Fisher Scientific X5-500 suffices as a substitute
Molecular Biology Grade 2-Propanol	Sigma	I9516
AllPrep FFPE DNA/RNA Kit	Qiagen	80234	Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21
Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solution	Qiagen	80234	Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21
Temperature stable proteinase K	Qiagen	80234
High potency proteinase K	Invitrogen	25530-049	Invitrogen 25530-015 suffices as a substitute
RNAse neutralizing solution (Rnase AWAY)	Molecular BioProducts	7003
RNaseA 100 mg/ml	Qiagen	19101
BD Integra Syringe 3 ml 21G x 1/2	BD	305274
Motorized tissue homogenizer (TissueRuptor)	Qiagen	9001271	Fisher Scientific 14-261-29 suffices as a substitute
-20 °C and -80 °C Laboratory Freezer
Micro-Centrifuge with rotor for 2 ml tubes
Digital Vortex Mixer
Pipettes and filter tips
Heating blocks or water baths
Tris Hydrochloride	Amresco	0234
Sodium Chloride	Amresco	0241
Anhydrous Magnesium Chloride	Sigma	M8266
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma	L4509
Acrodisc 25 mm syring filters with 0.45 µm Supor membrane	Pall	PN 4614
Syringe with retracting BD PrecisionGlide needle 3 ml	BD Integra	305274
Hydrochloric Acid	BDH	3026
Multianalyte gene expression platfrom (nCounter ® CAE codeset and Nanostring nCounter platform)	Nanostring nCounter platform, Nanostring
Fluorometric nucleic acid quantification (Qubit dsDNA HS Assay Kit and Qubit® RNA BR Assay Kit)	Invitrogen