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Resumo

Este protocolo descreve a dissecção e imunocoloração de adultos Drosophila melanogaster tecidos do cérebro. Especificamente, este protocolo destaca o uso da Drosophila cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios como subconjuntos neuronal de exemplo que podem ser usados com precisão para descobrir princípios gerais subjacentes a muitos aspectos do desenvolvimento neuronal.

Resumo

Desenvolvimento de sistema nervoso envolve uma série sequencial de eventos que são coordenados por diversas vias de sinalização e redes reguladoras. Muitas das proteínas envolvidas nestes caminhos são conservadas evolutivamente entre mamíferos e outras eucariotas, como a mosca de fruta Drosophila melanogaster, sugerindo que princípios organizadores semelhantes existem durante o desenvolvimento destes organismos. Importante, Drosophila tem sido amplamente utilizado para identificar mecanismos celulares e moleculares que regulam processos que são necessários em mamíferos, incluindo a neurogênese, diferenciação, orientação axonal e sinaptogênese. Moscas também têm sido utilizadas com sucesso para modelar uma variedade de doenças do desenvolvimento neurológico humano. Aqui descrevemos um protocolo para o passo a passo microdissection, fixação e imunofluorescência localização das proteínas dentro do cérebro adulto de Drosophila . Este protocolo centra-se em duas populações neuronal de exemplo, os neurônios do corpo cogumelo e fotorreceptores da retina e inclui etapas opcionais para rastrear os neurônios individuais corpo cogumelo usando análise de mosaico com uma técnica de marcador de célula Repressible (MARCM). Dados de exemplo do tipo selvagem e mutantes cérebros são mostrados juntamente com uma breve descrição dos critérios de Pontuação para orientação axonal defeitos. Enquanto este protocolo destaca dois anticorpos bem estabelecidos para investigar a morfologia do corpo cogumelo e neurônios fotoreceptor, outras regiões do cérebro de Drosophila e a localização de proteínas dentro de outras regiões do cérebro também podem ser investigada utilizando este protocolo.

Introdução

Embora o sistema nervoso de Drosophila é menor do que os seres humanos e roedores, sua complexidade fornece um modelo poderoso, acessível para entender melhor suas contrapartes de vertebrados. Em muitos casos, os genomas de vertebrados e moscas codificam proteínas muito similares que ditam os mecanismos do desenvolvimento do sistema nervoso. Na verdade, muitos dos genes necessários para desenvolvimento neuronal em vertebrados orthologs em moscas, incluindo aqueles envolveram nas vias de sinalização que controle a padronização, neurogênese e orientação axonal1,2,3 ,4,5. Por exemplo, netrin é um ligante necessário para orientação axonal em mamíferos e d. melanogaster6,7,8. Embora netrin foi originalmente isolado de tecido de cérebro embrionário garota6, estudos posteriores revelaram que netrin desempenha um papel conservado durante o desenvolvimento embrionário sistema nervoso central (CNS) em Drosophila8. Outros estudos têm usado telas genéticas no embrionário Drosophila CNS para identificar conservadas ligantes e receptores necessários para pathfinding em ambos Drosophila e vertebrados9.

Enquanto a mosca embrionária CNS tem sido amplamente utilizada no passado para identificar ligantes, receptores e proteínas de sinalização intracelulares obrigatório para orientação axonal8,9, trabalho recente investigou as maneiras em que muitos de Estas proteínas também controlam as decisões pathfinding durante os estágios posteriores de desenvolvimento. Especificamente, investigação do corpo cogumelo (MB) e desenvolvimento de neurônio fotorreceptoras da retina (Figura 1) forneceu insights sobre os mecanismos que controle pathfinding, formação de sinapse, poda de axônio e vários outros aspectos da neuronal desenvolvimento de10,11,12,13,14,15,16,17. Neurônios fotorreceptoras conectem a retina voar para regiões do cérebro adulto chamado a lâmina e medula e são crítico para veicular a informação visual ao cérebro (revisto por18,,19), enquanto os neurônios de cogumelo corpo são Centralmente localizado no cérebro voar e são necessários para aprendizagem e memória de20,21. Tanto os neurônios fotoreceptor e os neurônios intrínsecos dos corpos cogumelos, chamados células de Kenyon, utilizam mecanismos evolutivamente conservada contato-dependente e diffusible axonal orientação para encontrar os alvos pós-sinápticos. Além de ser visível em moscas adultas, fotorreceptoras e neurônios MB podem também ser diretamente visualizados em larvas e pupas com anticorpos ou repórter genes22,23,24,25. A capacidade de facilmente visualizar estes dois conjuntos de neurônios em pontos diferentes do desenvolvimento tempo promoveu sua utilização como excelentes modelos para muitos aspectos do desenvolvimento neuronal.

Além de ser usado como um modelo para entender os mecanismos do desenvolvimento normal do sistema nervoso, estudos recentes têm demonstrado que moscas também podem servir como modelos precisos de uma grande variedade de doenças humanas, incluindo a síndrome de X frágil (FXS)26 , Deficiência intelectual (ID)27,28,29,30,31e outros32. Por exemplo, para estudar a função molecular de ZC3H14, um gene recentemente ligado à deficiência intelectual humana, criamos um modelo mosca de ID usando um alelo nulo da mosca ZC3H14 ortholog, chamado Nab230. Moscas, falta Nab2 têm deficiências graves de memória e estendidas caudas poli (a), sintetizando o que é observado em pacientes humanos ou paciente derivada de célula linhas33,34. Importante, moscas falta Nab2 também exibem defeitos de morfologia cerebral grave em seus corpos cogumelo adulto34, semelhante ao que é observado em moscas, falta o gene da síndrome FXS, FMR135. Assim, moscas podem servir como um organismo modelo importante para estudar tanto o desenvolvimento normal do cérebro e doenças que interrompem-lo.

Finalmente, a acessibilidade dos métodos de alto throughput para monitorar o comportamento, combinado com a vasta gama de ferramentas disponíveis e genéticas, fazer drosófila um organismo modelo de escolha para identificar as regiões do cérebro que controlam comportamentos complexos, tais como aprendizagem e memória, sono, namoro, sede e outros36,37,38,39. Uma ferramenta particularmente útil é o centro da "toolbox" mosca do geneticista é o sistema de GAL4/UAS (Figura 2). Este sistema de40,41 usa expressão específica de tecido do Gal4 ativador transcricional para aumentar a expressão de genes ou transgenes a jusante de um Upstream ativando sequência (UAS). Modificações deste sistema tem permitido aos pesquisadores, por exemplo, controlar com precisão a excitabilidade dos neurônios específicos42,43, overexpress ou batida para baixo genes específicos de interesse44, 45, analisar a dinâmica em tempo real de cálcio na vivo46e expressar genes repórter para marcar linhagens neuronal41. A combinação do sistema GAL4/UAS com recombinação mitótica também permitida a criação da análise de mosaico com um marcador de célula Repressible (MARCM) sistema12,47. MARCM tem sido amplamente utilizado no rastreamento único neurônio para identificar os componentes de sinalização celulares necessários para orientação axonal12,47. Embora estas e outras técnicas apresentaram uma série de informações valiosas sobre os mecanismos celulares necessários para o funcionamento do sistema nervoso, a maioria exige que o cérebro de Drosophila primeiro ser dissecado; remoção cuidadosa do cérebro é necessária para manter o cérebro correto padrões morfologia e conexão entre regiões do cérebro. O seguinte protocolo usa cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios comopopulações neuronal de exemplo como ela orienta a dissecação e cérebros de Drosophila imunofluorescência de coloração de adulto.

Protocolo

1. genética da drosophila melanogaster e procedimentos opcionais de choque de calor

Cruzaram-se
  1. uma vez moscas e progênie F1 eclodiram, obter fêmeas e/ou machos do genótipo adequado. Dependendo da região do cérebro a ser investigada, moscas devem ser recolhidas diariamente e separados por sexo, para que a idade-dependente e/ou sexualmente dimórficos padrões de conectividade do cérebro podem ser mais facilmente distinguidos.
    Nota: Opcional: se moscas estão sendo usadas para análise de mosaico com um marcador de célula Repressible (MARCM) análise 12 , 47, embriões, larvas ou pupas devem ser chocado a 37 ° C por 30-45 min de calor induzi a recombinação mitótica. Fim de direcionar a regiões específicas dos organismos de cogumelos para análise MARCM, choque de calor deve ser cronometrado de acordo com o calendário determinado pelo 12 e descrito na Figura 5 B. Se usando MARCM para investigar regiões do cérebro que não sejam os corpos de cogumelos, experimentos piloto devem ser realizados para determinar o estágio ideal para ser calor-choc. Enquanto os seguintes passos são escritos no que se refere aos eclosed voa, pharate adultos também podem ser dissecados usando essas etapas, uma vez que foi removido o caso pupal.

2. Preparação de estação de dissecação

  1. posição do microscópio estereoscópico e luz fonte com anexado goosenecks óptica de fibra em uma bancada grande. Para promover os movimentos de mão firme e reduzir a mão " shake " enquanto dissecando, é essencial que o espaço adequado de mão e braço resto está disponível ao redor do microscópio. Certifique-se de que há cerca de 8-10 polegadas em ambos os lados do microscópio e 4-6 polegadas entre a base do microscópio e a borda da bancada.
    2. Poços de preenchimento 2 ou 3
  2. de um vidro bem-9 ou 3-bom prato com 1,0 mL de tampão PTN (0.1 M de fosfato de sódio tampão pH 7,2, 0,1% de surfactante não iônico, consulte a tabela de materiais para componentes do amortecedor completo) e coloque junto à estação de dissecação no gelo. Cérebros recém dissecados serão transferidos para este prato e armazenados até a etapa de fixação.
    1. Nota: se a imagem ao vivo é necessária, dissecação buffer deve ser 1x tampão de fosfato tamponado salino (PBS) ou HL3 48. Se a localização intracelular da proteína é necessária, PBS também pode ser usado como um alternativo buffer para dissecção e fixação. Após fixação, permeabilização de membranas celulares deve então ser realizada utilizando PTN lavagens contendo detergente não iônico 0,1% ou 0,3%.
    2. Se PBS é usado para as dissecções e fixação, pontas de pipeta devem ser enxaguado pelo menos uma vez com um buffer contendo detergente (como PTN) para evitar cérebros de degola para as pontas de pipetas plásticas durante transferência para tubos microcentrifuga.
  3. Usando um vidro vazio de 35mm ou prato de plástico petri, construir um prato de dissecação contendo um elastómero de silicone. Brevemente, misturar os componentes de elastômero de acordo com o fabricante ' direções s, despeje em pratos de 35mm e deixá-lo polimerizar durante a noite sobre uma superfície plana. Elastômero contendo pratos de dissecação deve ser usado para proteger as pontas bem de dissecando o fórceps, que facilmente pode ser danificado se o contato é feito entre a pinça e uma superfície mais dura, como um prato de vidro. Nós também regularmente comprar pratos disponíveis comercialmente silicone revestido de varejistas online. Para aumentar o contraste durante as dissecções, pratos de dissecação de elastômero do silicone contendo carvão inactivada (e assim colorido preto) são particularmente úteis.

3. Procedimento de dissecação cerebral adulto

  1. Anesthetize 3 a 5 dias de idade adulta d. melanogaster com CO 2 ou usando gelo. Se usar o gelo, lugar que impede que o frasco contendo voa de cabeça para baixo (Conecte a ponta para baixo) em um balde de gelo para ~ 5 min. colocar o frasco no gelo de cabeça para baixo voa a partir de tornando-se alojou na comida. Depois de moscas têm sido anestesiadas, coloca as moscas em uma sessão metal fria da almofada ou placa de Petri em gelo ou em um de CO 2, emitindo almofada voar. Se a dissecar cérebros para analisar a neurodegeneração, moscas mais velhas também podem ser usadas.
  2. Coloque uma pequena quantidade (150-200 µ l) de PTN no centro do prato dissecação usando uma pipeta de transferência ou uma pipeta p200 para criar um " bolha " de PTN. Coloque o prato de dissecação sob o microscópio estereoscópico e ajustar a iluminação e foco para que a bolha de PTN preenche o campo de visão e uniformemente iluminada.
  3. Manipular moscas para que eles sejam " barriga até " (ou seja, lado ventral para cima) enquanto estava deitado sobre o metal ou CO 2 pad.
  4. Usando um par de pinças de #5, segure o abdômen de uma mosca para serem dissecados e, mantendo o controle da mosca, completamente submirja no PTN sobre o prato de dissecação.
    Nota: Para o restante do protocolo, todas as etapas devem ser executadas enquanto a cabeça está submersa no PTN.
  5. Usando um segundo par de pinças de #5, segure a base de mosca probóscide e puxe os dois pares de pinças separados para separar a cabeça voar do corpo. Descarte o abdômen e o tórax. Durante esta etapa, é fundamental que a cabeça não é liberada e permitida flutuar na superfície do PTN. Uma vez que a cabeça está flutuando, pode ser muito difícil de agarrar novamente sem esmagar o cérebro.
    Nota: Usando este método, as conexões entre o cérebro e o cordão nervoso ventral estão rompidas. Se intactos conexões entre essas regiões do SNC são necessárias, um protocolo de dissecação alternativos, tais como 49 , 50, deve ser seguido. Se o narigudo desprende a cabeça voar antes que a cabeça é removida, haverá um buraco onde estava o narigudo. Nesse caso, segure a cabeça do mosca na borda do buraco perto de um olho. Em seguida, retire a cabeça usando uma quantidade moderada de força enquanto puxa os dois pares de pinças para além de um outro. Ocasionalmente, quando a cabeça é removida do corpo, os restos de cabo do intestino e/ou ventral do nervo anexado na cabeça e deve ser removidos antes de continuar a dissecação.
  6. , Enquanto um par de pinças apreende o narigudo, o segundo par deve agarrar a borda medial do olho direito de voar. Lentamente, puxe a pinça para além de um outro. Esta etapa deve ser realizada com uma pequena quantidade de força lateral constante. Como os fórceps mova lentamente para além de um outro, o narigudo deve afastar a cabeça e criar um buraco central na cutícula do chefe. Descartar a tromba com o primeiro par de pinças sem liberar a porção medial do olho direito do segundo par.
    Nota: O adulto cérebro d. melanogaster é o caudal (ou seja, posterior/parte traseira) região da cabeça voar. Assim, segurando aquela região da cabeça deve ser evitada. Idealmente, apenas o rostral (ou seja, frente) porção da cabeça perto da retina medial deve ser agarrada diretamente pela pinça. O cérebro e traqueia associada agora devem ser visíveis através do orifício central da cutícula. Neste momento, qualquer brancos Barbantinho segmentos de traqueia salientes do furo podem ser removidos e descartados.
  7. Com o segundo par de pinças, segure a borda medial da retina esquerda (na borda do furo central na cutícula da cabeça). Para remover as retinas e cutícula associada, puxe lentamente o fórceps longe um do outro num ângulo de 180 °. Como a retina dissocia-se do lobo óptico subjacente, você deve sentir uma ligeira diminuição da tensão. Avançar lentamente para evitar rasgar o lobo óptico.
    Nota: Separando a pinça também rapidamente durante esta etapa pode resultar no rasgar de the óptica lobo ou ruptura das estruturas do corpo cogumelo. Ocasionalmente, a cutícula será removida, mas peças da retina permanecerá presa no lobo óptico. Se os corpos cogumelos de imagem, não é completamente necessário remover a retina inteira. No entanto, análise de outras regiões do cérebro (como a inervação neurônio da retina dos lóbulos cerebrais óptica) pode exigir a retina para ser completamente removidos conforme descrito por 48 , 51.
    Nota: Como a retina é lentamente separou o lobo óptico subjacente do cérebro, o lobo óptico deve ser observável como uma estrutura branca opaca, coberta de branca, Barbantinho traqueia. Uma vez que uma retina foi removido, podem ser descartada. Ao analisar o pathfinding de neurônios da retina, particular cuidado durante esta etapa para evitar danos no lobo óptico. Um protocolo adicional focada em dissecação e imagens ao vivo dos neurônios fotoreceptor é também disponível 48.
  8. Agora, cuidadosamente Retire o máximo da traqueia visível quanto possível. A traqueia pode já conter ou depois encher de ar, causando cérebros de flutuar e, potencialmente, ser perdida durante as etapas posteriores de imunocoloração. Para remover a traqueia, pegá-lo fora do cérebro usando um par muito afiado de fórceps #5.
  9. Remover o restante da retina e cutícula circundante usando ambos os pares de pinças para agarrar a região medial da retina esquerda voar. Cuidadosamente rasgar a retina ao meio para remover pedaços da retina e da cutícula. Em alguns casos, removendo a cutícula restante sem esmagar o cérebro prova especialmente desafiador. Nestes casos, encontramos que as restantes vertentes do cordão nervoso ventral em vez disso podem ser aproveitadas por um par de pinças enquanto o outro par de pinça é usado para remover cuidadosamente o último da cutícula.
  10. Usando uma pipeta p200, mover cérebros dissecados para bem do prato 9 - ou 3-bem que contem PTN. Cérebro com o mesmo genótipo deve ser agrupado para o mesmo bem e mantido no gelo. Tecido cerebral deve ser fixado dentro de uma hora de dissecação. Cérebro pode ser fixo em pequenos lotes e pool se é necessário um maior número de cérebros. Na maioria das circunstâncias, um investigador experiente geralmente pode dissecar um cérebro e transferi-lo para o prato de coleta de vidro em aproximadamente 3-5 min.

4. Fixação e procedimento de coloração imunofluorescente

  1. usando uma pipeta p200, transferir cérebros dissecados do prato 9-bem para um tubo de 0,5 mL microcentrifuga preenchido com 0,5 mL de paraformaldeído 4% diluído em PTN. Cérebros de pelo menos 10-15 com o mesmo genótipo podem ser combinados em um tubo de microcentrifugadora. Todas as etapas restantes (até montagem de cérebros para slides) são concluídas em tubos de 0,5 ml microcentrifuga.
    Cuidado: Paraformaldehyde (PFA) deve ser tratado em uma coifa. Resíduos PFA devem ser salvo e criterioso. 20% paraformaldeído comprado em ampolas de vidro pode ser aliquotadas microcentrifuga tubos e armazenado a-20 ° C até ser necessário.
  2. Dentro de uma coifa, incubar os miolos em paraformaldeído 4% por 20 min com velocidade lenta de balanço à temperatura ambiente.
  3. Após a fixação, permitir que cérebros resolver a parte inferior do tubo microcentrifuga pela gravidade.
    Nota: Ocasionalmente, o cérebro pode ficar ao lado do tubo do microcentrifuge. Se isso ocorrer, é geralmente útil para girar lateralmente o tubo entre o dedo indicador e o polegar ou para tocar suavemente o tubo no banco para promover o afundamento dos cérebros.
  4. Fixador de remover usando um p1000 Pipetar e executar duas " rápida " lava com 500 µ l de PTN, permitindo que o cérebro resolver a parte inferior do tubo microcentrifuga entre lavagens. Durante estas lavagens rápidas, uma vez que todos os cérebros se instalaram por gravidade para o fundo do tubo microcentrifuga, o PTN pode ser imediatamente trocado por buffer de fresco; sem tempo de lavagem adicional é necessário.
    Nota: Normalmente, deixando o buffer de extra no tubo é preferível arriscar a remoção do cérebro. Exame cuidadoso da ponta da pipeta é geralmente necessário para garantir que não tem miolos foram retirados por engano o tubo. Se cérebro ter sido acidentalmente pipetado na ponta, dispensar-lhes volta no tubo de microcentrifuga, esperar o cérebro resolver e continue a remover qualquer PTN extra que permanece.
  5. Após a última lavagem rápida, usar uma pipeta p1000 para executar três " longa " lava: adicionar 500 µ l de PTN e lavagem por 20 min em temperatura ambiente em um balancim/nutator. Todos os futuros " longa " lavagens devem ser de 20 min.
    Nota: Seguir estas lavagens, fixada o cérebro pode ser armazenado durante a noite a 4 ° C em PTN.
  6. Remover a última lavagem, usando uma pipeta p1000 e incubar cérebros em um balancim ou nutator à temperatura ambiente em 0,5 mL de solução [PTN + 5% de soro de cabra normal (NGS)] durante pelo menos 30 min à temperatura de bloqueio.
    1. Anticorpos secundários de cabra será usado em etapas posteriores do protocolo. Se forem usados anticorpos secundários de outra espécie, soro normal de que espécie (ao invés de NGS) deve ser usado nas soluções de bloqueio e anticorpo.
  7. Usando uma pipeta p1000, remover a solução de bloqueio e adicionar o anticorpo primário diluído em PTN (PTN + 5% NGS + anticorpo primário diluído). Ao usar um anticorpo primário pela primeira vez, a diluição ideal de que os anticorpos deve ser determinada empiricamente.
    Nota: Para poder visualizar os neurônios do corpo cogumelo, anticorpos reconhecendo Fas2 são normalmente usados. Estes anticorpos estão disponíveis do banco de hibridoma a estudos do desenvolvimento (DSHB) como anticorpo 1 4 e deve ser diluído 01:20 em PTN + 5% NGS.
    Nota: Para poder visualizar os neurônios fotoreceptor, anticorpos reconhecendo chaoptin são normalmente usados. Chaoptin anticorpos estão disponíveis a partir do DSHB como anticorpo 24B10 e devem ser diluídos 01:20 em PTN + 5% NGS.
    Nota: O processo de fixação normalmente elimina fluorescência de proteína fluorescente, tais como a proteína verde fluorescente (GFP). Portanto, ao usar MARCM para analisar axonal orientação dos neurônios individuais de MB, usar um anticorpo reconhecendo GFP.
  8. Incubar os miolos em solução de anticorpo primário em um balancim/nutator por 2-3 noites em 4 ° C.
  9. Após incubação com os anticorpos primários, permitir que cérebros resolver a parte inferior do tubo microcentrifuga e remover a solução de anticorpo primário.
  10. Usando uma pipeta p1000, executar 2 " rápida " lavagens e 3 " longa " 20 min lava-se com 0,5 mL de PTN como descrito acima em etapas 4.4 e 4.5, cuidadosamente permitindo cérebros para resolver por gravidade para o fundo do tubo microcentrifuga entre cada Wash.
  11. Incubar cérebros para 3h em temperatura ambiente com apropriado fluorescente etiquetado anticorpos secundários. Anticorpos secundários são geralmente diluídos em 0,5 mL de PTN + 5% NGS em uma concentração de 1: 200.
    Nota: Uma vez que foram adicionados anticorpos secundários fluorescentes, cérebros devem ser mantidos no escuro para o restante do experimento.
    Nota: em caso residual GFP fluorescência vestígios, ao realizar a análise MARCM, é aconselhável a utilização de um anticorpo secundário rotulado com um fluoróforo tendo comprimentos de onda de excitação/emissão semelhantes como as boas práticas agrícolas (por exemplo, Fluoroscein isothyocyanate (FITC) ou Alexa488).
  12. Após a incubação do anticorpo secundário, permitir que cérebros para se estabelecer no fundo do tubo microcentrifuga e remover a solução de anticorpo secundário.
  13. 2 executar " rápida " lavagens e 3 " longa " 20 min lava-se com 0,5 mL de PTN como descrito acima em etapas 4.4 e 4.5, cuidadosamente permitindo cérebros para resolver a parte inferior do tubo microcentrifuga entre cada Wash.
  14. Após o terceiro " longa " 20 min lavagem, uso uma pipeta p200 para remover tanto buffer possível.
    15. Meio de montagem de
  15. Adicionar 75 µ l de fluorescente antidesvanece-se para o cérebro. Cérebros de pipeta e o meio de montagem para a ponta da pipeta uma vez para misturar. Não inverter o tubo, desde que o cérebro pode ficar preso na tampa ou os lados do tubo microcentrifuga.
    Nota: Após suspensão de cérebro no meio de montagem, tubos podem ser embrulhados em papel de alumínio para retardar o fluoróforo têmpera e armazenados a 4 ° C durante a noite. Se necessário, cérebros pode ser armazenados por vários dias a 4 ° C, mas idealmente deve ser montados em slides logo que possível.

5. Cérebros de adultos d. melanogaster para microscópio desliza e imagem de montagem

  1. construir um " ponte " slide. Posicione dois " base " lamelas aproximadamente 1 cm separado em um slide carregado positivamente. Certifique-se de que o lado carregado positivamente do slide é virada para cima. Aderir as lamelas para o slide com esmalte de unha como mostrado na Figura 3. É geralmente útil selar as bordas exteriores três de cada base lamínula com esmalte de unha para assegurar meios de montagem não pavio sob estes base lamínulas. Deixe a unhas secar completamente (10-15 min) antes de prosseguir.
  2. Colocar o slide sob o microscópio estereoscópico e adicionar a solução de montagem mídia contendo os cérebros dissecados para o espaço entre as duas lamelas. Para fornecer mais contraste, é útil manobrar as luzes de pescoço de cisne para que eles sejam paralelos com a bancada.
  3. Remover extra montagem mídia de slide usando uma pipeta, tomando cuidado para não pipetar o cérebro fora do slide.
    4. Meios de montagem extra fora
  4. wick. Isso permitirá que o cérebro deve ser posicionado mais precisamente durante a próxima etapa.
  5. Usando um par de pinças e o microscópio estereoscópico, posicione o cérebro do slide em um padrão de grade com lóbulos da antena virada para cima
  6. Colocar uma lamínula (o " ponte ") sobre o cérebro ( Figura 3). Use unha polonês para selar os lados da lamínula a ponte onde eles contatam o " base " lamínulas.
  7. Lentamente usando uma pipeta p200, encher a cavidade de centro debaixo da ponte com mídia fresco de montagem ( Figura 3 B). Coloque uma gota de cada vez na extremidade aberta da lamela centro e permitir que a mídia de montagem para pavio sob a centro ponte lamela. Continuar até que toda a cavidade é preenchida com a montagem de mídia, em seguida, selar a parte superior e inferior com esmalte de unha clara.
  8. Depois que secar as unhas, as lâminas de imagem imediatamente ou armazenar em uma caixa de slides apertado opacos em -20 ° C.
  9. Dentro de uma semana, usando um microscópio confocal de varredura a laser com lasers de excitação de cérebro de imagem e filtro cubos apropriados para os anticorpos secundários fluorescentes escolhidos. Imagens de Z-pilha de neurônios cogumelo corpo normalmente são obtidas usando 20 X ou 40 X de objectivos. Imagem de neurônios fotorreceptoras da retina pode exigir maior ampliação.

Resultados

O método descrito acima permite a visualização confiável e reprodutível de praticamente qualquer região do cérebro adulto drosófila . Aqui temos focado no cogumelos corpos e fotoreceptor neurônios, mas outros estudos utilizaram métodos semelhantes para visualizar regiões do cérebro como a pars intercerebralis52, relógio neurônios53,54e da antena lobo projeção neurônios55, entre muitos outros. Importante, esta técnica pode ser usada para visualizar estruturas do cérebro inteiro tanto neurônios individuais dentro dessas estruturas utilizando técnicas como MARCM12,47. Figura 4, Figura 5e Figura 6 mostram vários tipos diferentes de dados de corpos cogumelos e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos que podem ser gerados usando esta técnica de dissecção e imunocoloração.

Primeiro, o método descrito acima pode ser usado para visualizar diretamente a morfologia de cogumelo corpo usando os anticorpos que reconhecem Fasciculin 2 (Fas2) ou genes repórter expressados em corpo cogumelo neurônios34. Como mostrado na Figura 4 e Figura 4B, Fas2 anticorpos podem ser usados para visualizar o α, β e (em menor grau) lóbulos γ dos corpos cogumelos em adultos Drosophila cérebros. Fas2 é uma proteína de adesão célula-célula necessária para neurônio fasciculação e é expresso em níveis elevados no α e β lóbulos23,56,57, tornando-se um marcador confiável e bem estabelecido destes cogumelos neurônios do corpo. Notavelmente, o corpo de elipsoide de forma circular, localizado na região central do cérebro adulto também pode ser visualizado usando este anticorpo(Figura 4).

Defeitos de proteínas axonal orientação muitas vezes causam incompleta penetrante corpo cogumelo fenótipos mutantes15,34,35. Portanto, na maioria das circunstâncias, várias dezenas de cérebro deve ser fotografado e analisado. Por exemplo, os axônios de lobo β cogumelo corpo das moscas nulos Nab2 inadequadamente cruzam a linha média do cérebro. Este fenótipo de "fusão" lobo "crossing over" ou β normalmente é observado em ~ 80% dos adultos Nab2 nulo voa, mas é principalmente ausente dos controles do selvagem-tipo e pode ser classificada como leve, moderada ou completa fusão34. A "fusão" dos lobos β do outro lado da linha média resulta da projeção incorreta contralateral de axônios no hemisfério oposto do cérebro. Como mostrado na Figura 4C e detalhadas em34,35, ligeira fusão refere-se a lóbulos β, ligados por um "fio fino de fibras Fas2-positivo," enquanto fusão moderada refere-se mais lobos substancialmente conectada β que mostram uma espessura ligeiramente diminuída lobo na linha. Fusão completa (ou "extrema") refere-se a lóbulos β que estão totalmente ligados e mostram sem diminuição da espessura do lóbulo ou Fas2 coloração na linha. A extensão da fusão de lóbulo cogumelo corpo β pode ser quantificada e exibida como demonstrado em 34,35 ou como uma tabela que mostra a porcentagem do cérebro mostrando cada tipo de defeito de morfologia.

Além de coloração com anticorpos Fas2, o de47,de12,48 MARCM técnica também pode ser usado para visualizar as decisões de orientação de axônio dos neurônios individuais de GFP+ dentro dos lóbulos corpo cogumelo. MARCM utiliza recombinação mitótica durante o desenvolvimento para criar neurônios individuais ou grupos com uma relação clonal de neurônios, marcados com GFP (Figura 5A). MARCM fornece uma maneira para gerar um pequeno número de neurônios que falta completamente uma proteína dentro de um caso contrário heterozigoto voar. Como tal, esta técnica tem sido especialmente útil para analisar as funções de orientação axonal de proteínas que são também essenciais para a viabilidade global dos12,47. Homozigotos nulos neurônios marcados com GFP podem ser comparados diretamente para controlar os neurônios marcados com GFP em um fundo genético do selvagem-tipo. Além disso, dependendo de quando em desenvolvimento de larvas ou pupas são calor-chocado, diferentes classes de cogumelo corpo neurônios podem ser alvo (Figura 5B).

Um exemplo do tipo de dados gerados usando esta técnica é mostrado na Figura 5C, onde o selvagem-tipo (ou seja, controle) MARCM clones são gerados como um exemplo. Para gerar os neurônios de cogumelo corpo individuais GFP+ mostrados na Figura 5C, desenvolvendo F1 larvas foram inicialmente alojadas em 25 ° C. Aproximadamente 5-6 dias após a eclosão larvar (ALH), pupas foram calor chocado por 30 min a 37 ° C e em seguida retornou a 25 ° C até a eclosão. Após a eclosão do adulto, cérebros foram dissecados no PTN, fixo e simultaneamente incubados com anticorpos reconhecendo Fas2 (1, 4, diluído 01:20 em PTN) e GFP (diluído 1: 500 em PTN). Cérebros foram então incubados com anticorpos secundários e montados em slides conforme descrito acima. Células GFP+ foram identificadas e fotografaram usando um microscópio confocal de varredura a laser e projeções de intensidade máxima foram criadas usando o ImageJ. Como demonstrado na Figura 5C, controle de GFP+ neurônios gerados nos lóbulos α e β colocalize com Fas2 e terminar antes de contatar a linha que separa os dois hemisférios do cérebro drosófila . Um único axônio projetos anteriormente, bifurca e então os dois projetos dorsalmente e medialmente ao formulário o α e β lóbulos. Vários estudos anteriores usaram esta técnica para investigar se determinadas proteínas são necessárias para estudar a divisão celular autonomamente para muitos aspectos da axonogênese, incluindo a extensão, pathfinding, ramificação e/ou poda10, 11,12,13,14,15,16,17,34.

Além dos corpos de cogumelos, as decisões de pathfinding axonal de neurônios fotorreceptoras da retina (R-células) podem também ser visualizadas usando o método de dissecação descrito acima (bem como o de método de dissecaçãocrito em referência48). Cada omatídeos dentro do olho de mosca contém 8 neurônios fotorreceptoras que podem ser classificados em três grupos (Figura 1): R1-R6 células, que se projetam axônios para a lâmina superficial do cérebro lobo óptico; R7 as células, que se projetam axônios para a camada mais profunda da M6 da medula; e o R8 células, que se projetam axônios para a camada intermediária de M3 da medula19,58. O padrão de projeção de cada classe de fotorreceptoras tem sido estudado extensivamente, e juntos esses neurônios foram usaram com sucesso como um modelo para compreender as vias de sinalização envolvidas no axônio orientação19,59. Importante, todos os axônios fotorreceptoras podem ser facilmente visualizados em cérebros dissecados de drosófila por imunocoloração do adulto, pupa, ou tecidos larvais usando um anticorpo que reconhece chaoptin, glicoproteína24, de superfície de uma célula 60 , 61. genes repórter expressando GFP ou β-galactosidase em cada tipo de R-células (células R1-R6, R7 e R8) também foram construídos e pode ser usados para visualizar cada classe de fotorreceptoras62. Desde que cada tipo de célula-R termina em uma camada diferente do lobo óptico em desenvolvimento, esses repórteres permitiram comparações detalhadas das vias sinalização necessárias para cada tipo de célula corretamente encontrar seu alvo. Um exemplo dos padrões de expressão produzida por dois destes genes repórter em combinação com a localização de chaoptin (que pode ser usada como um marcador de todos os neurônios fotorreceptoras) é mostrado na Figura 6. Para visualizar o R7 fotorreceptores, cérebros contendo o gene repórter do R7 específicos Rhodopsin4-LacZ foram dissecados e manchados com anticorpos anti-chaoptin e β-galactosidase. Rhodopsin 4 (Rh4) é expressa especificamente em um subconjunto do R7 células63; o promotor Rh4 , portanto, pode ser usado para dirigir a expressão do gene repórter só nestas células. Como esperado, as células R7 encerrar na camada mais profunda da M6 da medula (indicada com uma linha pontilhada amarela Figura 6). Da mesma forma, o cérebro expressando β-galactosidase da rodopsina 6 (Rh6) promotor, que é expressa especificamente no R8 fotorreceptores63, foram dissecados e immunostained usando anticorpos reconhecendo chaoptin e Β-galactosidase. Como mostrado na Figura 6, R8 fotorreceptores encerrado na camada de R3 amedula. Embora não mostrado aqui, Rh1-LacZ também pode ser usado para visualizar a finalização do R1-R6 fotorreceptores na lâmina.

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Figura 1: o adulto Drosophila melanogaster cérebro consiste em regiões funcionalmente distintas mas interligadas. Cérebro (A), um esboço do adulto d. melanogaster é mostrado, destacando os corpos cogumelos centralmente localizados e neurônios fotorreceptoras da retina periférica. (B) diagrama alargada dos feixes de axônio corpo cogumelo adulto (também chamados lóbulos) que são reconhecidos por anticorpos Fas2. Os neurônios intrínsecos dos corpos cogumelos, chamados células de Kenyon, projeto axônios anteriormente de corpos celulares localizados dorsalmente (corpos celulares omitidos neste diagrama) e formam estruturas distintas de lobo. No cérebro de um adulto, a forma de lóbulos (mostrado em vermelho) γ de um único feixe medial de axônios, enquanto o α dorsal e forma de lóbulos (mostrado em azul) β medial de um único axônio que se bifurca durante o processo de pathfinding. Α ' / β' neurônios desenvolvem lóbulos axonal que parcialmente se sobrepõem com os dos neurônios α/β, mas não são reconhecidos pelos anticorpos Fas2 e são omitidos neste diagrama. Os neurônios da retina (C) são fundamentais para veicular a informação visual da retina o lobo óptico. Projeto de axônios de corpos celulares localizados na retina (bege) e conexões de formulário com células alvo pós-sináptica na lâmina ou medula. R1-R6 fotorreceptoras células (mostradas em vermelho) formulário específicas ligações com células na camada exterior do lobo óptico, chamado a lâmina. R7 fotorreceptoras células sinapse (amarelo) com alvos na camada M6 da medula, enquanto as células R8 (mostradas em verde) projeto axônios para a camada de M3 ligeiramente mais superficial da medula. Parte C adaptado com permissão da Macmillan Publishers Ltd: natureza neurociência (referência64, copyright (2011)). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: GAL4/UAS o sistema pode ser usado para a expressão do gene alvo. Para obter expressa um gene de interesse ("Gene X") em um padrão específico de tecido de moscas, moscas devem conter tanto um transgene expressando a proteína ativador transcricional de Gal4 sob o controle de um potenciador de tecido específico um transgene contendo o DNA de Gal4 ligação de sequência (chamada de Upstream ativando sequência ou UAS) adjacente ao Gene X. normalmente, essa combinação é alcançada acasalamento moscas parentais que cada um contém um transgene e selecionando para progênie de F1 que contêm ambos. Na geração1 F resultante, Gal4 será expressa e ligará para a UEA para ativar a transcrição do Gene X de uma maneira específica de tecido. Importante, os transgenes UAS contendo diferentes pode ser usado em combinação com a mesma GAL4 "motorista". Por exemplo, um transgene expressando Gal4 nos órgãos do cogumelos (MBs) pode ser combinado com um transgene UAS-contendo a GFP expresso, um transgene que derruba a expressão de um gene de interesse, usar interferência de RNA ou um transgene-UAS que produz um repórter. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3 : Montagem o cérebro na preparação para a imagem latente de imunofluorescência. (A) cérebros são montados em slides SuperFrost Plus com uma tampa de ponte para evitar o achatamento dos cérebros. Duas lamínulas "base" são aderiu a um slide Superfrost Plus carregado positivamente, com esmalte de unha clara e cérebros dissecados são então colocados no slide entre eles. Um deslizamento da tampa clara "ponte" é colocado sobre o cérebro e aderido as base lamínulas. (B) uma vez o esmalte de unha seco, Vectashield é pipetado lentamente sob a ponte para preservar a fluorescência do anticorpo secundário. Esmalte de unha clara é usado para selar a parte superior e inferior da lamínula "ponte". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Axônios de corpo cogumelo podem ser claramente visualizados usando anticorpos que reconhecem Fas2. (A) adulto Drosophila cérebros foram dissecados, fixo e incubados com anticorpos reconhecendo Fas2. Anticorpos primários foram reconhecidos usando anticorpos secundários acoplados Alexa488 da cabra-anti-mouse e cérebros foram montados em slides carregado positivamente e fotografaram usando um microscópio confocal de varredura de laser. Bisymmetrically localizado cogumelo celular corpo corpos estendem axônios anteriormente, bifurcam e formam feixes de axônio (também chamados lóbulos). Axônios que formam os lóbulos α dorsalmente saliente e medialmente saliente em lóbulos β expressam Fas2. Criticamente, lóbulos do β do selvagem-tipo moscas encerrar antes da linha média do cérebro. O corpo de forma elipsoide centralmente localizado também pode ser visualizado usando o 4-1 anticorpo. Axônios de lóbulo γ (B) o medialmente saliente do corpo adulto cogumelo Drosophila também expressar Fas2 e pode ser visualizados usando o 4-1 anticorpo. Normalmente, a expressão de Fas2 em axônios de lóbulo γ é menor do que dos lobos α e β. (C) o corpo cogumelo axônios dos cérebros de Nab2 nulo (genótipo: Nab2ex3/Nab2ex3) mis projeto contralaterally e muitas vezes falta lóbulos. Nab2 nulo cérebros foram dissecados, fixo e manchados com o 4-1 anticorpo Visualizar corpo cogumelo α, β e γ lóbulos. Projeções de intensidade máxima Z-pilha seções óticas, bem como individuais focadas na região da linha média são mostradas. Enquanto axônios de lobo selvagem-tipo cogumelo corpo β raramente cruzarem a linha média do cérebro, cérebro nulo Nab2 têm quantidades variáveis de projeção mis do outro lado da linha mediana no hemisfério cerebral contralateral, resultando em lóbulos β "fundidos". Conforme definido em referências34,35, fusão suave refere-se a < lóbulos β com apenas vários "fios" de axônios, cruzando a linha mediana, fusão moderada refere-se a situações onde neurônios de lobo Fas2 β positivo entre o lóbulo da linha mediana mas β do cérebro largura na linha é reduzida, e fusão completa refere-se a situações onde não há nenhuma redução de espessura de lóbulo β como os lobos cruzam a linha média do cérebro. Desde que o corpo de forma elipsoide também expressa Fas2, seções óticas mostrando a linha média são frequentemente mais útil em Visualizar a fusão do lobo β. Notavelmente, faltando lóbulos são também frequentemente observados (denotada aqui com o asterisco branco). Dados na parte C são usados na quantificação dos fenótipos de cogumelo corpo de referência34, com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5 : MARCM pode ser usado para visualizar os axônios dos neurônios único. (A) análise de mosaico com uma marcador de célula Repressible (MARCM) usos FLP mediada por recombinase mitótica recombinação em sites FRT para criar duas células distintas. Neste exemplo, todas as células contêm uma proteína de GAL4 cogumelo corpo específico em um cromossomo separado. Após a recombinação mitótica durante a divisão celular, uma célula filha (topo) expresse GFP (ou a membrana vinculado CD8-GFP) e contém dois alelos mutantes de um gene de interesse, enquanto a outra célula filha (inferior) herda dois alelos de tipo selvagem (WT) e um transgene expressando a proteína Gal80 usando um promotor de tubulina. Gal80 inibe Gal4, então qualquer células produzindo Gal80 serão não-fluorescente e devem ser heterozigoto ou homozigoto selvagem-tipo. Somente as células que são GFP+ conterá duas cópias do alelo mutante. Observe que apenas um dos vários métodos para a geração de células GFP+ que também contêm dois alelos mutantes de um gene de interesse é mostrado; por favor ver12,,45,56 para outros exemplos. (B) desde que o desenvolvimento dos neurônios do corpo cogumelo começa com os neurônios γ, então α'/ β' os neurônios e termina com os neurônios α/β, cada classe de neurônio seletivamente pode ser direcionado e visualizado pelo calor chocante em pontos diferentes de tempo no desenvolvimento. Conforme descrito em 12, um choque de calor de 40 min a 37 ° C que ocorre ≤2.5 dias após incubação larval (ALH) especificamente alvejará γ; neurônios, enquanto o choque térmico que ocorre 3.5-4.5 dias ALH (no final estágio larval L3) terá como alvo α'/ β' os neurônios e um calor que o de choque ccurs entre 5-7 dias ALH (durante o desenvolvimento pupal) terá como alvo os neurônios α/β. (C) axônios individuais do selvagem-tipo foram visualizados usando MARCM. Pupas de tipo selvagem ~ 5-6 dias velho (genótipo: hsFLP, UAS-CD8-GFP; Banheira de FRT82B, UAS-CD8-GFP/FRT82B, > Gal80; OK107-GAL4/+) chocaram calor a 37 ° C por 40 min induzir recombinação mitótica. Cérebros foram dissecados, fixo e manchados com anticorpos reconhecendo GFP (1: 500) e Fas2 (01:20). Cérebros foram então incubados com anticorpos secundários fluorescente etiquetados e visualizados por microscopia confocal. Esses dados de exemplo de um genótipo "controle", GFP positivas geradas usando MARCM de células são tipo selvagem e em vez de conter os dois alelos demut gene, contêm dois alelos de geneWT . Lóbulos de cogumelo corpo β (visualizados usando anticorpos reconhecendo Fas2) terminar antes de chegar à linha média do cérebro; Neurônios de lóbulo α também estão presentes. Para mostrar mais detalhes, uma ampliada em virtude de um hemisfério do cérebro único é mostrada na linha de fundo de imagens. Parte C foi adaptado com permissão de referência34. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6 : Axônios fotorreceptoras também podem ser visualizados. Cérebros de adultos expressando β-galactosidase em R7 fotorreceptores (à esquerda, usando Rh4-LacZ) ou fotorreceptores R8 (direita, usando Rh6-LacZ) foram dissecados, fixo e incubadas com anticorpos reconhecendo a β-galactosidase ou chaoptin. Cérebros em seguida foram incubados com anticorpos secundários fluorescente etiquetados e visualizados por microscopia confocal de varredura de laser. Única seções óticas são mostradas de cada cérebro. À esquerda, vários axônios de fotorreceptoras R7 (setas) podem ser vistos de terminação a camada mais profunda da M6 da medula (mostrada pela linha pontilhada amarela). À direita, axônios de fotorreceptoras R8 (setas) terminam na camada exterior do M3 da medula (mostrada pela linha pontilhada verde). Desde que o R7 fotorreceptores expressam ou Rh3 ou fotorreceptores Rh4 e R8 expressam Rh5 ou Rh663, todos os fotorreceptores R7 ou R8 não podem ser visualizados usando um único gene do repórter LacZ . Barras de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O método de dissecação e visualização descrito acima pode ser usado em uma ampla variedade de imunocoloração e vive aplicativos de imagem. Nós esboçamos um protocolo geral imunocoloração e evidenciaram uma maneira em que MARCM pode ser usado para visualizar axonal morfologia de neurônios individuais corpo cogumelo. Além disso, estes procedimentos gerais também podem ser usados para outras regiões do cérebro em fixo de imagem ou adulto recém dissecado cérebros48,65. Imagem ao vivo pode fornecer uma abordagem mais eficiente quando analisar padrões de expressão de armadilhas potenciador, genes repórter ou imitar linhas66, por exemplo. Para evitar a captura artefatos de morte celular durante a imagem latente ao vivo de GFP em tecido não fixado, cérebro deve ser dissecado em 1 x fosfato tamponado salino (PBS) ou HL3 mídia48, montado em lâminas de ponte em 1X PBS (ou HL3) e fotografado em menos de 15-20 min. cuidados também deve ser tomado para remover tanto a traqueia quanto possível do cérebro dissecado antes da imagem latente, uma vez que isso pode interferir na visualização da fluorescência de GFP.

Enquanto a coloração condições para avaliar a morfologia de neurônios corpo e fotoreceptor cogumelos são relativamente bem estabelecidos24,61,67, a localização de uma proteína específica de interesse destas células tipos podem exigir extensa de solução de problemas e otimização. Em particular, várias etapas críticas, incluindo diluição de anticorpo, bloqueio reserva componente concentração e fixação, devem ser otimizadas para gerar os resultados mais reprodutíveis e confiáveis. Em primeiro lugar, deve ser determinada a concentração ideal do anticorpo primário. Embora anticorpos comercialmente disponíveis têm frequentemente uma diluição sugerida (e muitas vezes inicialmente começamos usando essa concentração), esses valores raramente são determinados empiricamente sobre os tecidos da drosófila . Portanto, testando uma série de diluições de anticorpo primário que escala acima e abaixo a sugestão inicial do fabricante muitas vezes resulta em coloração mais específico. Enquanto a diluição do anticorpo primário pode ter um efeito significativo na coloração de precisão e deve ser precisamente determinada, o cérebro de tempo é incubado no anticorpo primário contendo soluções podem variar consideravelmente com pouco efeito sobre o resultado geral. Por exemplo, observamos resultados semelhantes quando incubando dissecou cérebros com o anticorpo primário do anticorpo Fas2 para dois, três, ou quatro dias a 4 ° C. Embora recomendamos pelo menos duas noites, temos também incubados cérebros em solução de anticorpo primário por uma noite e obteve coloração reprodutíveis. Importante, limitando a quantidade de tempo que cérebros são incubados no anticorpo secundário para 3h em temperatura ambiente (ou uma noite a 4 ° C) ajuda limite inespecificas de anticorpos secundários ao tecido cerebral.

Em segundo lugar, pode ser necessário usar reagentes adicionais de "bloqueio" para eliminar o sinal de fundo indesejado. Opções incluem o aumento da concentração de NGS para ~ 10%, a adição de 1-10% albumina de soro bovino (BSA) para o bloqueio e primário/secundário soluções do anticorpo ou pre-adsorção de anticorpos primários durante a noite a 4 ° C, com embriões da drosófila (ver referência68, seção 2.9, passo 3).

Enquanto escrevemos o protocolo acima usando PTN como o buffer sugerido para a fixação de todas, a lavagem e as etapas de incubação do anticorpo, fixação de tecidos em outros buffers (como PLP e PEM, listados na Tabela de materiais) pode resultar em profundas diferenças em a força do sinal. Por exemplo, estudos anteriores demonstraram que Cyclin E é indetectável em discos imaginária larvas, quando os tecidos são fixos no tradicional paraformaldeído 4%, diluído em PBS, mas é claramente visível quando os tecidos são fixos no buffer PLP (Ken Moberg, pessoal comunicação e referência69). Além das alterações no buffer de componentes, alterando o tempo e a temperatura, para fixação de tecido pode afetar também significativamente imunofluorescência mancha e pode ser determinados empiricamente, se necessário. Geralmente, tempo de fixação deve ser tempo suficiente para permitir a reticulação suficiente de componentes celulares, e a manutenção a longo prazo da morfologia geral celular estando limitado o suficiente para impedir over-reticulação e "enterrar" de epitopos de proteína. Portanto, quando inicialmente otimizando coloração condições para um anticorpo primário recém-adquiridas, geralmente limitar o tempo de fixação de aproximadamente 20 min e muitas vezes irá corrigir os tecidos em temperaturas mais frias.

Vários controles devem ser incluídos em qualquer experimento de imunofluorescência para investigar a especificidade dos anticorpos primários e secundários, bem como o efeito de transgenes/genético sobre o fenótipo observado. Para verificar se o anticorpo primário sendo usado especificamente reconhece a proteína de interesse, tecido de moscas falta desta proteína ou tecido superexpressão da proteína deve ser incluído como controles. A adição de proteína antígeno purificado em excesso também pode ser incluída para determinar se o anticorpo primário reconhece outros resumos no cérebro voar. Finalmente, qualquer sinal fluorescente presente quando os anticorpos primários são omitidos representa o nível de ligação não-específica pelos anticorpos secundários selecionados.

Vários controles importantes também devem ser incluídos para avaliar a contribuição do fundo genético ou a presença de transgenes para coloração de intensidade ou morfologia neuronal. Por exemplo, as moscas usadas no experimento MARCM na Figura 5 contêm múltiplos transgenes (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, banheira > GAL80 e OK107-GAL4), cada um dos quais deve ser analisado separadamente para efeitos na morfologia do corpo cogumelo. Em uma morfologia muito mínimo, cogumelo corpo de moscas contendo OK107-GAL4 e UAS-CD8-GFP deve ser analisada. Também pode ser necessário avaliar o efeito do choque térmico e produção de recombinase Flp no desenvolvimento do cogumelo corpo analisando voa contendo hsFLP e FRT82B. Embora MARCM pode fornecer informações sobre significativo se uma proteína dada forma autônoma controla a orientação axonal, o número de controles necessários para fazer com precisão esta conclusão pode ser uma limitação menor desta técnica. Em experiências menos complicadas, controles similares também são aplicáveis. Por exemplo, tome um experimento onde o sistema de GAL4/UAS está sendo usado em combinação com um transgene RNAi para "knockdown" expressão de uma proteína de interesse em todos os neurônios. Neste experimento, pelo menos dois transgenes estará presentes: um driver de GAL4 pan-neuronal, como DrosÃ-GAL4 e o transgene UAS-RNAi . A morfologia de neurônios do corpo cogumelo em moscas, contendo cada uma destas transgenes sozinhos deve ser investigada para além da condição experimental onde moscas abrigam ambos os transgenes na mosca da mesma.

Finalmente, para determinar se a proteína de interesse é expressa em neurônios do corpo cogumelo é geralmente necessário cérebros co mancha com anticorpos para Fas2. Alternativamente, proteínas fluorescentes, tais como a GFP, RFP ou a membrana vinculado CD8-GFP também podem ser expressas usando o sistema de GAL4/UAS e usado em combinação com anticorpos reconhecendo a proteína de interesse. Desde que Fas2 só reconhece os fasciculado axônios que formam os lóbulos de cogumelo corpo α e β, o uso de GAL4-driven, membrana-limite CD8-GFP tem sido particularmente útil para a marcação de cogumelo corpo neurônios.

Defeitos na orientação axonal muitas vezes não são 100% penetrante e até mesmo o cérebro com o mesmo genótipo pode mostrar alguma variabilidade. Portanto, quando analisando recém gerado alelos mutantes para defeitos no corpo cogumelo ou pathfinding fotoreceptor, deve ser utilizada uma combinação de abordagens e diferentes alelos. A maioria dos estudos na literatura usar várias abordagens diferentes para investigar se uma proteína desempenha um papel célula autónomos em controlar a orientação axonal: eu) análise de pathfinding defeitos em homozigotos moscas nulos (de preferência usando diferente nualelos de ll), ii) análise de pathfinding defeitos em moscas falta da proteína de interesse somente nos neurônios (geralmente via RNAi), iii) análise MARCM de pathfinding defeitos e iv) resgatar experiências onde o gene é re-expressado nos neurônios homozigotos NULL moscas. Idealmente, várias dezenas de cérebros por genótipo devem ser analisados para defeitos na morfologia neuronal.

Embora o protocolo descrito aqui centra-se principalmente na imunofluorescência localização das proteínas dentro do tecido fixo, várias aplicações futuras desta técnica estão sendo desenvolvidas para o tecido do cérebro ao vivo de imagem. Uma vez que os cérebros são dissecados (geralmente em meios de cultura de células), então podem ser cultivadas durante vários dias a 25 ° C. Esses ex vivo métodos de cultivo estão sendo desenvolvidos a fim de investigar uma ampla variedade de processos biológicos, tais como a atividade de proteína que promove a regeneração do axônio após lesão70,71, intracelular sinalização dinâmica72e desenvolvimento neuronal73.

Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer Changhui Pak e Jeferson Vrailas Mortimer inicialmente ensinando SMK a técnica de dissecação do cérebro. Agradecemos também a membros do grupo de Ken Moberg laboratório, especialmente Chris rodadas, para ler criticamente o manuscrito. Anticorpos reconhecendo Fas2 (1 4) e chaoptin (24B10) foram obtidos a partir do banco de hibridoma de estudos do desenvolvimento. Anticorpo 24B10 foi depositado para o DSHB por Seymour Benzer e Nansi Colley24,60,,61, anticorpo 1 4 foi depositado para o DSHB por Corey Goodman 22,23,56. Estoques de moscas foram obtidos a partir do centro de estoque de Bloomington. Gostaríamos também de agradecer a Ohio agrícola centro de pesquisa e desenvolvimento centro (OARDC) MCIC Imaging para uso do microscópio confocal a imagem do cérebro na figura 4A e B. SMK é suportado por um fundo de FORMULADORES (1 R15 HD084241-01A1).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Microdissection forceps/tweezersTed Pella505-NM
Sylgard dishesLiving Systems InstrumentationDD-50-S-BLKAvailable from amazon.com
Fas2 AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank1D4
Chaoptin AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank24B10
GFP AntibodyAves LabGFP-1010
Alexa488 goat anti-mouse secondary antibodyThermoFisherA-11001
Alexa488 goat anti-chicken secondary antibodyThermoFisherA-11039
Alexa647 goat anti-mouse secondary antibodyThermoFisherA-21236
20% paraformaldehydeElectron Microscope ServicesRT15713
VectaShieldVector LabsH-1000
SuperFrost Plus SlidesThermoFisher99-910-01
CoverslipsThermoFisher12-553-454
Na Phosphate Buffer monobasicSigmaS3139
Na phosphate Buffer dibasicSigmaS3264
Triton X 100SigmaX100-100ml
fingernail polishElectron Microscope Services (EMS)72180
stereomicroscopeLeica S6D with KL300 LED light source
9-well dish (spot plate)VWR89090-482
nutator/rockerFisher22-363-152 or 88-861-041
35mm dishGenesee Scientific32-103
SylgardFisher50-366-794
KimwipeFisher06-666
NameCompanyCatalog NumberComments
Potential Fixation Buffers
PTN Buffer0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed
PLP buffer2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O
PEM buffer0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA
NameCompanyCatalog NumberComments
Fly Stocks available from Bloomington
elav (c155)-GAL4BL458Pan-neuronal GAL4 driver
w*;;;OK107-GAL4BL 854GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome)
y(1), w(67c23); c739-GAL4BL 7362GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome)
y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFPBL 64305GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP
w*; 201Y-GAL4BL 4440GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome)
y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFPBL 64296GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP
w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub>Gal80/CyOBL 5145MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome
w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFPBL5146MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub>GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4BL 44408MARCM stock for flipping 3rd chromosome
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub>GAL80;OK107-GAL4BL44406MARCM stock for flipping 2nd chromosome
w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4BL 44407MARCM stock for flipping X chromosome
y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyOBL 5137GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein)
y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFPBL 5139MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome
y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyOBL 28832MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome
w*; FRTG13, Tub>GAL80BL 5140MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome
y(1), w*;; FRT82B, Tub>GAL80BL 5135MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome

Referências

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