Tomografia de emissão de pósitrons para medição in vivo de conteúdo de mielina no modelo de rato de lysolecithin de esclerose múltipla

Resumo

Este protocolo tem o objetivo de monitorar as alterações in vivo da mielina (desmielinização e remielinização) por meio da tomografia de emissão de pósitrons (PET) em um modelo animal de esclerose múltipla.

Resumo

A esclerose múltipla (EM) é uma doença neuroinflamatória com expansão da degeneração axonal e neuronal e desmielinização no sistema nervoso central, levando a disfunções motoras, incapacidade psíquica e comprometimento cognitivo durante a progressão da EM. A tomografia de emissão de pósitrons (PET) é uma técnica de imagem capaz de quantificar alterações celulares e moleculares in vivo.

Os radiotracers com afinidade com a mielina intacta podem ser usados para imagens in vivo de alterações de conteúdo de mielina ao longo do tempo. É possível detectar um aumento ou diminuição do teor de mielina, o que significa que esta técnica de imagem pode detectar processos de desmielinização e remyelinação do sistema nervoso central. Neste protocolo demonstramos como usar a imagem PET para detectar alterações de mielina no modelo de rato de lisesolecithin, que é um modelo de lesão de desmielinização focal (induzida por injeção estereotática) (ou seja, um modelo de doença da esclerose múltipla). ¹¹ A imagem PET C-PIB foi realizada na linha de base, e 1 semana e 4 semanas após injeção estereotaxica de lisolecithin 1% no estriado direito (4 μL) e corpus calosum (3 μL) do cérebro de rato, permitindo quantificação de desmielinização focal (local de injeção após 1 semana) e o processo de remielinização (local de injeção em 4 semanas).

A imagem myelin PET é uma ferramenta interessante para monitorar mudanças in vivo no conteúdo de mielina que poderiam ser úteis para monitorar a progressão da doença desmielinina e a resposta terapêutica.

Introdução

A esclerose múltipla (EM) é uma doença neuroinflamatória que afeta o sistema nervoso central, caracterizada por inflamação, desmielinização e perda axonal¹. O prognóstico dessa doença é variável mesmo com avanços no tratamento, sendo uma das causas mais comuns de déficits neurológicos em jovens¹. O diagnóstico de ESM baseia-se nos critérios de manifestação clínica e visualização de lesões características por ressonância magnética (RM)^2,3.

A tomografia por emissão de pósitrons (PET) pode ser uma ferramenta útil para o monitoramento in vivo da progressão da ESM e dos efeitos terapêuticos. O radiotracer B composto de Pittsburgh (PIB) rotulado com carbono-11 (¹¹C-PIB) é amplamente utilizado para quantificar placas β-amilóides; no entanto, na última década, tem sido estudado para quantificar o conteúdo da mielina e mostrar desmielinização dinâmica e remyelination^4,5,6.

Diferentes rastreadores PET amiloides (¹¹C-PIB, ¹⁸F-florbetaben,¹⁸F-florbetapir, ¹⁸F-flutemetamol) podem ser usados para quantificar a mielina e fornecer informações importantes sobre a progressão da doença e resposta terapêutica, permitindo a identificação de processos de desmielinização e remyelinação, sem a interferência da neuroinflamation, que pode ocorrer com imagens convencionais de ressonância magnética (MRI)⁷. A imagem pet amiloide mostrou diminuição da absorção de rastreadores em pacientes ativos de ES em comparação com pacientes não ativos, o que poderia ser explicado por danos precoces à matéria branca nos pacientes ativos⁸. A menor absorção de rastreador amiloide também esteve associada ao declínio cognitivo em um estudo de acompanhamento, mostrando que essa técnica é uma ferramenta valiosa para o estudo da fisiopatologia da doença e dos desfechos clínicos⁹.

O modelo de rato de lisesolecithin (LPC) é um modelo induzido químico de esclerose múltipla, onde a toxina injetada, LPC, induz uma alta resposta de macrófagos que resulta em aumento da inflamação e, consequentemente, desmielinização^10,11. A dessalinização é rapidamente invertida, em aproximadamente 4 semanas, o que torna este um bom modelo para avaliar processos de desmielinização e remyelinação em roedores. Este modelo já foi avaliado utilizando imagem PET, com bons resultados e correlação com ensaios post-mortem¹².

Aqui apresentamos o protocolo para imagem PET de mielina com ¹¹C-PIB no modelo de rato de lisesolecithin, mostrando que essa técnica de imagem é uma ferramenta útil para a medição in vivo do conteúdo de mielina.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do Conselho Nacional de Controle da Experimentação Animal (CONCEA, Brasil) e aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (CEUA-FMUSP) - número do protocolo: 25/15).

NOTA: Neste protocolo, mostramos como induzir um modelo de rato de esclerose múltipla e como adquirir e analisar as imagens PET de mielina.

1. Preparação da solução de lysolecithin

1. Pesar lysolecithin (L-α-Lysophosphatidylcholine de gema de ovo) em uma escala analítica usando um tubo plástico conic (1,5 mL).
2. Adicione soro fisiológico estéril ao tubo para fazer 1% de solução (por exemplo: pesar 1 mg de lisecitina e dissolvê-lo com 100 μL de soro fisiológico) e dissolver a lisecirina sacudindo o tubo (balançando de um lado para o outro e não girando de cima para baixo).
3. Prepare a solução pouco antes de iniciar a indução do modelo animal (não estocar a solução pronta final).

2. Modelo de rato de lysolecithin - Cirurgia estereotaxica

1. Use ratos Wistar machos pesando entre 220 e 270 g. Use luvas e máscara durante todos os procedimentos.
2. Induzir anestesia com 5% de isoflurane misturado em 100% O₂ (1 L/min) usando uma caixa de indução. Verifique se o animal está anestesiado observando a ausência de movimento (somente a respiração deve ser observada).
3. Coloque o animal em aparelho estereotaxo em uma almofada de aquecimento. Conserte o nariz e as orelhas do animal no equipamento.
   NOTA: Detalhes de como realizar cirurgia estereotaxa podem ser encontrados no Banco de Dados de Educação Científica da JoVE. Neurociência. Cirurgia Estererófica de Roedores. JoVE, Cambridge, MA, 2021.
   1. Monitore a anestesia durante todo o procedimento (incluindo cirurgia e aquisição de imagens). Para ajustar a concentração de isoflurane, observe a taxa de respiração animal. Uma taxa de respiração rápida requer maior concentração e uma taxa de respiração lenta requer menor concentração anestésico.
4. Injete o analgésico (cetoprofeno - 5 mg/kg) subcutâneamente (diluir a medicação para 1 mL em soro fisiológico, isso ajudará a hidratar o animal).
5. Coloque creme nos olhos do animal para proteger contra a desidratação.
6. Use uma solução de clorexidina de 0,5% para limpar a área de incisão.
7. Injete 100 μL de cloridrato de lidocaína 2% subcutâneamente na região da incisão.
8. Raspe a área do crânio.
9. Use instrumentos estéreis para este procedimento.
10. Usando um bisturi, faça uma incisão de cerca de 2 cm na pele sobre o crânio.
11. Exponha o crânio com grampos bulldog.
12. Use um cotonete para limpar a área do crânio com 1% de peroxidase de hidrogênio.
13. Localizar e marcar o bregma (um atlas cerebral de rato estereotaxic pode ajudar a identificar o Bregma).
14. Posicione a seringa Hamilton (seringas neuros μL) no bregma.
15. Usando o bregma e um atlas estereotaxic como referência, posicione a seringa Hamilton nas seguintes coordenadas: Antero-posterior: -0,30 mm, latero-lateral: -3,0 mm e ventral até tocar o osso do crânio, e marque o crânio e observe a orientação das coordenadas no papel.
16. Perfurar o crânio na coordenada marcada. Tome cuidado com dura mater (danificar dura mater pode causar um monte de sangramento).
17. Encha a seringa Hamilton com 7 μL de solução de lisecitina (1% em soro fisiológico). Um volume maior pode ser colocado na seringa, mas apenas 7 μL será injetado (tire as bolhas da seringa para medir o volume corretamente).
18. Posicione a seringa Hamilton nas coordenadas anteriores para iniciar a injeção de drogas (total de 7 μL em 3 coordenadas estereotáticas ventrais diferentes). Considerando as coordenadas previamente anotadas, baixe a seringa Hamilton para coordenar ventral -5,0 mm.
19. Injete lentamente 2 μL de solução de lisesolecithin (1 μL/10 min). Espere 3 min.
20. Leve a agulha até a próxima coordenada estereotaxica ventral (-4,2 mm) e injete lentamente 2μL de solução de liossolecithin (1 μL/ 10 min). Espere 3 min.
21. Injete a terceira coordenada ventral -3.0 mm (3 μL de solução de lisecitina - 1 μL/ 10 min).
22. Espere 5 min e depois remova a seringa Hamilton do cérebro.
23. Sutura a pele.
24. Remova o animal do aparelho estereotático e permita que o animal acorde.
25. Devolva o animal para a gaiola de casa, mantenha o animal sozinho e sob supervisão para verificar se há sinais de desconforto.
26. Injete analgésico subcutâneo (cetoprofeno - 5 mg/kg) diluído em soro fisiológico, a 24h e 48 h após a cirurgia.

3. Aquisição de PET

1. Tome de 7 a 20 MBq de ^{radioatividade}C-PIB em uma seringa (1 mL é o volume máximo permitido para injeção intravenosa em ratos).
2. Anestesiar o animal com 5% de isoflurane misturado em 100% O₂ (1 L/min) usando a caixa de indução.
3. Injete ¹¹C-PIB (radioatividade definida no item 4.1 acima) na veia peniana, ou veia traseira do rato (ambos os locais de administração são bons, a decisão é uma escolha pessoal. Nós apenas aconselhamos a não usar uma injeção retro-orbital, uma vez que o local é muito próximo da região de interesse (o cérebro) e pode prejudicar a qualidade da imagem.
   NOTA: A aquisição de imagem do ponto de tempo da linha de base é realizada antes da injeção estereotipada e os outros 2 pontos de tempo em 1 semana e 4 semanas após a cirurgia.
4. Retire o animal da anestesia para permitir que o animal acorde (deixe o animal em uma almofada quente até que ele esteja completamente acordado).
5. Devolva o animal para a jaula.
6. Espere 30 min para o próximo passo.
7. Anestesiar os ratos com 5% de isoflurane misturado em 100% O₂ (1 L/min) usando uma caixa de indução.
8. Abra o software de scanner PET.
9. Selecione Digitalização > Pronto para animais de estimação.
10. Detalhes completos do pesquisador principal, ID do Estudo, ID da Série, Y Animal, Peso Animal (g) e Notas adicionais. Selecione Next.
    NOTA: Use ponto (.) para número decimal no peso animal.
11. Editar área de ROI para digitalização (geralmente entre 3 e 8). Esta é a área que será incluída na imagem (áreas entre os números 3 e 8 da tampa da cama aparecerão na imagem final).
12. Posicione o rato anestesiado em um leito de rato padrão do scanner PET e ligue a anestesia (3% de isoflurane em 100% O₂ é um bom começo, e então a taxa de anestesia deve ser ajustada conforme necessário). Para ajustar a anestesia, verifique os dados de monitoramento do software do scanner para verificar se o animal está respirando em um ritmo constante e lento.
    NOTA: Ligue a bomba de vácuo acoplada ao filtro de carbono ativado para coletar o excesso de gás isoflurane (se a bomba estiver disponível).
13. Aplique creme para os olhos para proteger os olhos do animal.
14. Empurre a cama animal dentro do scanner PET.
15. Detalhes completos da atividade, tempo de calibração da atividade, isótopo (C-11) e duração da varredura (20 minutos). Selecione Iniciar varredura.
    NOTA: Uma mensagem de cama de movimento para animais aparecerá, e o leito animal se moverá para o equipamento e interromperá na posição de ROI previamente selecionada. O tempo de aquisição começará a contar e o número de contagens por segundo aparecerá (CPS).
16. No software do scanner, navegue até a guia Monitor à esquerda da tela, verifique a alteração do limiar de alteração para os parâmetros respiratórios (BPM).
    NOTA: Uma janela aparecerá, completa com parâmetro de limiar (500). Selecione OK.
17. Navegue até 0% DE POTÊNCIA para alterar os parâmetros de temperatura para aquecer o animal durante a varredura. Uma janela vai aparecer; completar o parâmetro (80 - 100). Selecione OK.
    NOTA: Escolha entre 80 e 100% de energia com base nas condições de temperatura ambiente (quanto mais energia, mais quente ele vai ficar).
18. Navegue de volta para a guia SCAN.
19. Navegue até a ferramenta de configuração (ícone de engrenagem) e complete o tempo de injeção, atividade restante, tempo de calibração de atividade restante. Selecione Salvar.
    NOTA: Uma janela aparecerá "Tem certeza de que deseja modificar os metadados do protocolo?" > SIM
20. Navegue de volta para a guia Monitor (verifique os parâmetros respiratórios do animal e, se necessário, aumente ou diminua a concentração de isoflurane - geralmente 3% em 100% O₂ é suficiente).
21. Quando a aquisição pet estiver concluída, a mensagem Pet Ready aparecerá na guia Scan, confira o Ícone de Seta (à esquerda da ferramenta de configuração) para mover a cama animal.
22. Retire o animal da anestesia e deixe despertar em uma almofada quente.
23. Para reconstruir aimagem, navegue até a guia Reconstruir.
24. Verifique mais ícone no canto inferior esquerdo da tela e selecione o arquivo de estudo que será reconstruído. Selecione Next.
25. Navegue até a ferramenta de Resolução de Energia. Uma janela vai aparecer. Configure o pico de energia (keV) no parâmetro do equipamento (com base no controle mensal de qualidade). Selecione Fechar.
    NOTA: O pico de energia pode mudar a cada mês ao realizar a calibração mensal do equipamento.
26. Mantenha todos os outros parâmetros como padrão (tamanho voxel isométrico: 400 mm; número de iterações: 30; Resolução de energia: 30%; Salvar apenas a última iteração; desmarcar Manter dados binários) .
27. Verificar Adicionar.
    NOTA: Uma janela aparecerá "A reconstrução foi adicionada à fila e começará assim que as outras terminarem". Selecione OK. Um arquivo aparecerá na lista de reconstrução na guia Reconstruir e o status aparecerá como espera ou % (progresso) ou terminado.

4. Análise de imagem

NOTA: Realize a análise de imagens usando um software dedicado de análise de imagens. No protocolo atual, a demonstração usa um programa de software específico, mas se não estiver disponível, outras opções podem ser usadas.

1. Abra PMOD > Fusa-o.
2. Navegue até a guia Matching na parte superior da tela.
3. Abra o menu De entrada de carga no meio direito da tela e selecione arquivos Autodetect, selecione arquivo PET (DICOM, Interfile ou NifTI), adicione aos selecionados, clique com Operações, Reoriente para Orientação Padrão, clique em Carregar e Fechar.
4. Verifique se a espécie animal está correta na parte inferior da tela(RAT).
5. Verifique a caixa Crop no canto inferior direito da tela.
6. Ajuste o tamanho da caixa amarela na imagem PET para levar todo o cérebro.
7. Clique no botão Rígido à direita da tela. Na janela de confirmação clique em Sim.
8. Clique na ferramenta cerebral no meio direito da tela para abrir o Atlas de Referência. Selecione Px Rat (W.Schiffer) - T2.
9. Selecione Resultados de correspondência na guia superior direita (Selecione a guia estágio de processamento).
10. Clique em Reslicing de dados (4ª guia no menu superior direito).
11. Alinhe a imagem PET com o modelo de referência usando a ferramenta rotativa (ícone branco no centro da imagem PET). Verifique o alinhamento de 3 aviões anatômicos.
12. Salve o arquivo de co-registro (menu lateral direito da tela).
13. Selecione o formato de saída (DICOMor NifTI), diretório e prefixo de arquivo. Clique em Salvar.
    NOTA: Se a saída co-registrada for salva como NifTi, as informações da imagem do cabeçalho serão perdidas.
14. Clique no menu VOIs na parte inferior da tela.
15. Navegue até o Modelo > Atlas na parte inferior da tela (abaixo da janela VOIs).
16. Selecione Px Rat (W.Schiffer) no menu suspenso.
    NOTA: Se você precisar analisar apenas VOIs específicos, você pode selecionar apenas as áreas de interesse do cérebro. Se você quer todas as áreas cerebrais do atlas cerebral, nenhuma ação é necessária.
17. Clique em Contorno na parte inferior da tela.
    NOTA: VoIs de áreas cerebrais aparecerão na janela VOIs.
18. Desenhe manualmente o VOI no local da lesão e na área do hemisfério cerebral contralateral (¹¹C-PIB área de baixa absorção e hemisfério cerebral contralateral, respectivamente).
19. Clique na área de imagem PET com ¹¹C-PIB de baixa absorção.
20. Selecione Novo VOI > OK.
    NOTA: Uma planilha aparecerá
21. Navegue até o ícone SPHERE na parte central da tela (à esquerda da janela VOIs)
    NOTA: Uma planilha aparecerá.
22. Escolha o nome VOI: lesão e selecione Aplicar.
    NOTA: Uma esfera aparecerá na imagem co-registrada.
23. Alinhe a esfera na área da lesão e ajuste o VOI para todos os planos anatômicos.
24. Clique em Fechar (na parte inferior da planilha).
25. Selecione o VOI da lesão (da lista VOIs).
26. Navegue até o ícone de operações de espelhamento voi (no canto superior direito da janela VOIs) e selecione Clone e espelho à esquerda/direita.
27. Navegue para calcular estatísticas voi selecionadas no topo da janela de lista VOIs. Navegue até Selecionar estatísticas para ser calculado ícone para escolher os dados de saída (para o lado direito do ícone de estatísticas VOI). Normalmente para verificação de conteúdo de mielina Estatísticas para grupo de VOIs, Média, SD, Min, Max).
    NOTA: Uma planilha aparecerá. A unidade de dados de configuração padrão é kBq/cc. Na parte superior esquerda da planilha (VOI Statistics) você pode verificar a Unidade de Dados como SUV (Valor de Absorção Padronizada). Se você completou os detalhes de administração de radiotracer e aquisição de imagens corretamente no software do scanner, como descrito anteriormente, os dados do SUV serão calculados automaticamente pelo software PMOD, se não, você poderá editar os detalhes.
28. Navegar para copiar usando o formato de número de localização do sistema.
    NOTA: Verifique se todas as estatísticas estão selecionadas para copiar como saída (Verifique o ícone na parte superior direita da tela). Os dados que serão copiados dependem da Unidade de Dados selecionada.
29. Cole os dados de saída em um bloco de notas ou planilha.
    NOTA: Tome cuidado com as configurações de software para símbolos de ponto e círia entre os números. Isso pode ser diferente entre as configurações do idioma.
30. Salve o arquivo com o nome do estudo e os detalhes.

Resultados

A Figura 1 mostra imagens ilustrativas ^{de 11}C-PIB PET com alterações de mielina ao longo do tempo. Na varredura da linha de base, não podem ser observadas diferenças no conteúdo da mielina (ou seja, não há desmielinização). Na imagem de ponto de tempo de 1 semana, é possível ver a lesão focal desmielinada (no hemisfério direito) como indicado pela seta branca. As imagens são apresentadas nos 3 planos anatômicos (coronal, axial e sagital) e é possível identificar a...

Discussão

A maior vantagem de usar o modelo de lisecitina para estudar a esclerose múltipla é o cronograma rápido para a desmielinização (cerca de 1 semana) e a remielinação (cerca de 4 semanas) para ocorrer¹⁴. Este modelo também pode ser induzido em camundongos¹⁵, no entanto, a indução em ratos é mais vantajosa para imagens in vivo PET devido ao tamanho maior do cérebro de rato em comparação com ratos.

O primeiro passo do modelo de ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytical Balance	Marte	AUWZZOD	max: 220 g- min: 1 mg
Anestesia vaporizer	Nanitech	15800
Beta-cube	Molecubes
Bulldog clamp	Stoelting	5212043P
clorexidine	Rioquimica		0.5%/100 mL
Cotton swabs	johnson e johnson
Dose calibrator	Capintech
Drill	Kinzo powertools	352901	Model Q0M-DC3C
Eppendorf tube	Eppendorf	30125150	1.5 mL
Eye lubricant	ADVFARMA	30049099	vaseline 15 g (pharmaceutical purity)
Fine forceps	Stoelting	52102-38P
Gloves	Descarpack	212101	6.5 size
Heating pad	Softhear
Injection Syringe	Hamilton	80314	10µ, 32ga, model 701
Insuline syringe	BD	328328	1 mL insulin syringes with needle
Isoflurane	Cristália	410525	100 mL , concentration 1 mL/1 mL
Ketoprofen or other analgesic	Sanofi		100 mg/2 mL
lidocaine	Hipolabor	1.1343.0102.001-5	2%/20mL
L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk	Sigma-aldrich	L-4129	25 mg - ≥99%, Type I, powder
Needle holder	Stoelting	5212290P
Oxygen	White Martins	7782-44-7	Compressed gas
PMOD software	PMOD technologies	Version 4.1	module fuse it
Rat anesthesia mask	KOPF	Model 906
Saline	Farmace	0543325/ 14-8	0.9% sodium chloride for injection, 10 mL
Scapel blades	Stoelting	52173-10
Scapel handles	Stoelting	52171P
Scissor	Stoelting	52136-50P
Semi-analytical Balance	Quimis	BK-3000	max:3,100 g; min:0.2 g
shaver	Mega profissional		AT200 model
Stereotactic Apparatus	KOPF	Nodel 900
Universal holder with needle support	KOPF	Model 1772-F1	Hamilton support for 5 and 10 µL