다발성 경화증의 리솔레시틴 쥐 모델에서 골린 함량의 생체 내 측정을 위한 양전자 방출 단층 촬영

요약

이 프로토콜은 다발성 경화증의 동물 모델에서 양성막 방출 단층 촬영 (PET) 이미징에 의해 생체 내 골수 (탈량 및 재마일레네이션)에서 모니터링하는 것을 목표로합니다.

초록

다발성 경화증 (MS)은 중추 신경계에서 축삭 및 뉴런 변성 및 탈량이 확대되는 신경 염증 성 질환으로 MS 진행 중에 운동 기능 장애, 심령 장애 및 인지 장애로 이어진다. 양전자 방출 단층 촬영 (PET)은 생체 세포 및 분자 변경에서 정량화 할 수있는 이미징 기술입니다.

myelin에 상냥함을 가진 Radiotracers는 시간이 지남에 따라 myelin 콘텐츠 변경의 생체 이미징에 사용할 수 있습니다. 골수린 함량의 증가 또는 감소를 감지할 수 있으며, 이는 이 이미징 기술이 중추 신경계의 탈량 및 재분화 과정을 감지할 수 있다는 것을 의미합니다. 이 프로토콜에서 우리는 포심 탈량 병변의 모델인 리솔자박 쥐 모델의 골린 변화를 감지하기 위해 PET 이미징을 사용하는 방법을 보여줍니다(즉, 다발성 경화증 질환의 모델). ¹¹ C-PIB PET 이미징은 기준선에서 수행되었으며, 쥐 뇌의 오른쪽 줄무늬(4 μL)와 코퍼스 캘로섬(3 μL)에서 리솔자틴 1%의 스테레오탁스 주입 후 1주 및 4주 후에 수행되었으며, 초점 탈량(1주일 후 주입 부위) 및 재량 처리(4주 후 주입 부위)의 정량화를 허용하였다.

Myelin PET 화상 진찰은 탈근질병 진행 및 치료 반응을 감시하는 데 유용할 수 있던 myelin 콘텐츠에 있는 생체 내 변경을 감시하기 위한 흥미로운 공구입니다.

서문

다발성 경화증(MS)은 염증, 탈생 및 축삭 손실^1을특징으로 하는 중추 신경계에 영향을 미치는 신경 염증 질환이다. 이 질병의 예후는 치료의 진보에도 가변적이며, 젊은 이들의 신경 적자의 가장 흔한 원인 중 하나입니다^1. MS의 진단은 자기 공명 영상 (MRI)^2,3에의한 특징병변의 임상 표현 및 시각화의 기준에^{기초한다.}

양전자 방출 단층 촬영 (PET)은 MS 진행 및 치료 효과의 생체 내 모니터링에 유용한 도구가 될 수 있습니다. 탄소-11(11C-PIB)으로 표지된 피츠버그화합물 B 방사성 추적기(PIB)는 β-아밀로이드 플라크를 정량화하는 데 널리 사용된다. 그러나, 지난 10 년 동안, 그것은 myelin 콘텐츠를 정량화하고 동적 탈량과 재myelination을 보여주기 위해 연구되었다^4,5,6.

다른 아밀로이드 PET 추적기(11C-PIB, ^{18F-florbetaben,18F-florbetapir, 18}F-florbetaamol)를 사용하여 골린을 정량화하고 질병 진행 및 치료 반응에 대한 중요한 정보를 제공하여 신경염증의 간섭 없이 탈근 및 재발 과정을 식별할 수 있으며, 이는 기존의 자기염증(MRIson)과 함께 발생할 수 있다. 아밀로이드 PET 이미징은 활성 환자 에서 초기 백색 물질 손상에 의해 설명 될 수있는 비 활성 환자에 비해 활성 MS 환자에서 감소 추적기 upup 을 보였다^8. 낮은 아밀로이드 추적자 섭취는 또한 후속 연구에서 인지 감소와 관련이 있었다, 이 기술을 보여주는 질병의 병리 생리학을 연구하기위한 귀중한 도구가 될^9.

리솔자박(LPC) 쥐 모델은 다발성 경화증의 화학적 유도 모델으로, 주입된 독소, LPC는 염증을 증가시키고 결과적으로 탈량^10,11을초래하는 대식세포의 높은 반응을 유도한다. 탈근은 약 4 주 만에 급속히 반전되어 설치류의 탈민화 및 재마일화 프로세스를 평가하기위한 좋은 모델입니다. 이 모델은 이미 PET 이미징을 사용하여 평가되었으며, 좋은 결과와 사후^{에세이(12)와}상관관계가 있다.

여기서 우리는 리솔레시틴 쥐 모델에서 ¹¹C-PIB를 가진 myelin PET 화상 진찰을 위한 프로토콜을 제시합니다, 이 화상 진찰 기술은 myelin 내용의 생체 내 측정을 위한 유용한 공구가 될 것을 보여주는.

프로토콜

모든 절차는 동물 실험 통제를 위한 국가 위원회의 지침에 따라 실시되었습니다 (CONCEA, 브라질) 상파울루 대학의 의과 대학의 동물 연구를위한 윤리위원회의 승인을 받았다 (CEUA-FMUSP, 브라질 - 프로토콜 번호: 25/15).

참고: 이 프로토콜에서는 다발성 경화증의 리솔자틴 쥐 모델을 유도하는 방법과 myelin PET 이미지를 획득하고 분석하는 방법을 보여줍니다.

1. 리솔레시틴 솔루션 준비

1. 정추형 플라스틱 튜브(1.5mL)를 사용하여 분석 척도에서 리솔레시틴(달걀 노른자에서 α-리소포스파디델콜린)을 계량합니다.
2. 튜브에 멸균 식염수를 추가하여 1% 용액(예: 리솔자틴 1 mg의 무게와 식염수 100μL로 용해) 튜브를 흔들어 리솔실시틴을 녹입니다(좌우로 흔들며 위에서 아래로 돌리지 않음).
3. 동물 모델 유도를 시작하기 직전에 솔루션을 준비하십시오(최종 준비 솔루션을 비축하지 마십시오).

2. 리솔레시틴 쥐 모델 - 스테레오탁틱 수술

1. 220-270 g 사이의 무게 남성 Wistar 쥐를 사용 하 여. 모든 절차 중에 장갑과 마스크를 사용하십시오.
2. 유도 상자를 사용하여 100% O₂ (1 L/min)에 혼합된 5% 이소플루란으로 마취를 유도합니다. 동물의 움직임이 없는 것을 관찰하여 마취되었는지 확인하십시오 (호흡만 관찰해야 합니다).
3. 동물을 가열 패드에 스테레오 탁스 장치에 놓습니다. 동물의 코와 귀를 장비에 고정합니다.
   참고: 스테레오탁스 수술을 수행하는 방법에 대한 자세한 내용은 JoVE 과학 교육 데이터베이스에서 확인할 수 있습니다. 신경 과학. 설치류 스테레오 탁스 수술. 조브, 케임브리지, 매사추세츠, 2021.
   1. 전체 절차 (수술 및 이미지 수집 포함)에 대한 마취를 모니터링합니다. 이소플루란 농도를 조정하려면 동물의 호흡 속도를 관찰하십시오. 빠른 호흡 속도는 더 높은 농도를 필요로하고 느린 호흡 속도는 낮은 마취 농도를 필요로한다.
4. 진통제 (케토프로펜 - 5 mg / kg)를 피하 (식염수로 1 mL로 약물을 희석하면 동물에게 수분을 공급하는 데 도움이됩니다).
5. 동물의 눈에 아이 크림을 넣어 탈수로부터 보호합니다.
6. 0.5% 클로르헨시딘 용액을 사용하여 절개 영역을 청소합니다.
7. 절개 부위에 100 μL의 리도카인 염산염 2%를 피하한다.
8. 두개골 부위를 면도합니다.
9. 이 절차에 는 멸균 기기를 사용합니다.
10. 메스를 사용하여 두개골 위에 피부에 약 2cm의 절개를 합니다.
11. 불독 클램프로 두개골을 노출합니다.
12. 면봉을 사용하여 1 % 수소 peroxidase로 두개골 영역을 청소하십시오.
13. 브레그마를 찾아 표시 (스테레오 탁스 쥐 뇌 아틀라스는 브레그마를 정체성하는 데 도움이 될 수 있습니다).
14. 해밀턴 주사기(μL neuros 주사기)를 브레그마에 배치합니다.
15. 브레그마와 스테레오탁스 아틀라스를 참조로 사용하여, 다음 좌표에 해밀턴 주사기를 배치 : Antero 후방 : -0.30 mm, 측면 : -3.0mm, 복부는 두개골 뼈에 닿을 때까지, 그리고 두개골을 표시하고 종이에 좌표 방향을 주의하십시오.
16. 표시된 좌표에서 두개골을 드릴. 두라 마터 (손상 두라 마터 출혈을 일으킬 수 있습니다)로주의하십시오.
17. 리솔자시틴 용액 7μL(식염수 1%)로 해밀턴 주사기를 채웁니다. 더 큰 부피는 주사기에 배치될 수 있지만 7 μL만 주입됩니다(주사기에서 거품을 꺼내 볼륨을 올바르게 측정합니다).
18. 약물 주사를 시작하기 위해 이전 좌표에 해밀턴 주사기를 배치 (총 7 μL 에 3 다른 복부 입체 좌표). 이전에 언급 된 좌표를 고려하여 해밀턴 주사기를 낮추고 복부 좌표 -5.0mm로 낮춥습니다.
19. 매우 천천히 리솔자박액 2 μL을 주입합니다(1 μL/10분). 3분 기다립니다.
20. 바늘을 다음 복부 스테레오탁스 좌표(-4.2 mm)까지 가져가서 2μL의 리솔자박액(1μL/10분)을 천천히 주입하십시오. 3분 기다립니다.
21. 세 번째 복부 좌표 -3.0 mm(리솔자박액 3μL - 1 μL/10분)를 주입합니다.
22. 5 분 기다린 다음 뇌에서 해밀턴 주사기를 제거합니다.
23. 피부를 봉합합니다.
24. 스테레오전술 장치에서 동물을 제거하고 동물이 깨어날 수 있도록 합니다.
25. 동물을 집 새장에 반환하고, 동물을 혼자 유지하고 감독하에 불편함의 징후를 확인하십시오.
26. 수술 후 24시간 48h에서 식염수로 희석된 피하 진통제(케토프로펜 - 5 mg/kg)를 주입합니다.

3. 애완 동물 취득

1. 주사기에서 ¹¹개의 C-PIB 방사능의 7 ~ 20 MBq를 가져 가라 (1 mL은 쥐의 정맥 주사에 허용되는 최대 부피입니다).
2. 유도 상자를 사용하여 100% O₂ (1 L/분)에 혼합된 5% 이소플루란으로 동물을 마취합니다.
3. ¹¹C-PIB (위의 항목 4.1에 정의 된 방사능)를 쥐의 음경 정맥 또는 꼬리 정맥에 주입 (두 관리 사이트는 모두 괜찮습니다, 결정은 개인적인 선택이다. 우리는 단지 위치가 관심의 영역 (뇌)에 너무 가깝고 이미지 품질을 손상 시킬 수 있기 때문에 복고풍 궤도 주입을 사용하지 않는 조언.
   참고: 기준 시간대의 이미지 획득은 스테레오탁스 주사 전에 수행되며 수술 후 1주 및 4주에 다른 2시간 포인트가 수행됩니다.
4. 동물이 깨어날 수 있도록 마취에서 동물을 제거하십시오 (완전히 깨어날 때까지 동물을 따뜻한 패드에 두십시오).
5. 동물을 홈 케이지로 돌려놓습니다.
6. 다음 단계를 위해 30분 기다립니다.
7. 유도 상자를 사용하여 100% O₂ (1 L/분)에 혼합된 5% 이소플루란으로 쥐를 마취시화합니다.
8. 애완 동물 스캐너 소프트웨어를 엽니 다.
9. 스캔 및 gt; 애완 동물 준비를선택합니다.
10. 전체 주요 조사자 세부 사항, 연구 ID, 시리즈 ID, 동물 ID, 동물 무게 (g) 및 추가 노트. 다음을선택합니다.
    참고: 동물 중량의 소수점 수에 점(.)을 사용합니다.
11. 스캔을 위해 ROI 영역을 편집합니다(일반적으로 3에서 8 사이). 이것은 이미지에 포함 될 영역입니다 (침대 덮개의 숫자 3과 8 사이의 영역이 최종 이미지에 나타납니다).
12. 마취를 PET 스캐너의 표준 쥐 침대에 배치하고 마취를 켭니다 (100 % O_2의 3 %이소플루란은 좋은 시작이며, 필요에 따라 마취 속도를 조정해야합니다). 마취를 조정하려면 스캐너 소프트웨어의 모니터링 데이터를 확인하여 동물이 일정하고 느린 리듬으로 호흡하고 있는지 확인하십시오.
    참고: 활성화된 탄탄 필터에 결합된 진공 펌프를 켜서 이소플루란 가스 과잉을 수집합니다(펌프가 사용 가능한 경우).
13. 동물의 눈을 보호하기 위해 아이 크림을 바르습니다.
14. 애완 동물 침대를 PET 스캐너 내부로 밀어 넣습니다.
15. 활동 세부 정보, 활동 교정 시간, 동위원소(C-11) 및 스캔 기간(20분)을 완료합니다. 시작 스캔을 선택합니다.
    참고: 애완동물 이동 침대 메시지가 나타나고, 동물 침대는 장비로 이동하여 이전에 선택한 ROI 위치에서 중지됩니다. 획득 시간이 카운트다운되고 초당 카운트 수가 표시됩니다(CPS).
16. 스캐너 소프트웨어에서 화면 왼쪽의 모니터 탭으로 이동하여 호흡 매개 변수 변경(BPM)으로 임계값 변경여부를 확인합니다.
    참고: 임계값 매개 변수(500)가 완료된 창이 나타납니다. 확인을 선택합니다.
17. 0%의 전원으로 이동하여 스캔 중에 동물을 가열하기 위해 온도 매개 변수를 변경합니다. 창이 나타납니다. 매개 변수를 완료합니다(80 - 100). 확인을 선택합니다.
    참고: 실온 조건에 따라 80~100% 전력을 선택합니다(전력이 많을수록 따뜻해집니다).
18. 다시 검색 탭으로 이동합니다.
19. 구성 도구(기어 아이콘)로 이동하여 주입 시간, 남은 활동, 잔여 활동 보정 시간으로 이동합니다. 저장을선택합니다.
    참고: 창이 "프로토콜 메타데이터를 수정하시겠습니까?" > 예
20. 모니터 탭으로 다시 이동 (동물의 호흡 매개 변수를 확인하고, 필요한 경우, 증가 또는 감소 이소플루란 농도 - 일반적으로 3% 100% O_2에 충분하다).
21. PET 수집이 완료되면 애완동물 준비 메시지가 스캔 탭에 나타나고 화살표 아웃 아이콘(구성 도구 왼쪽)을 확인하여 동물 침대를 이동합니다.
22. 마취에서 동물을 제거하고 따뜻한 패드에 각성을 허용합니다.
23. 이미지를 재구성하려면 탭 재구성으로 이동합니다.
24. 화면 왼쪽 하단에 플러스 아이콘을 확인하고 재구성할 스터디 파일을 선택합니다. 다음을선택합니다.
25. 에너지 해상도 도구로 이동합니다. 창이 나타납니다. 에너지 피크(keV)를 장비 매개변수(월별 품질 관리 기준)로 구성합니다. 닫기선택 .
    참고: 월간 장비 교정을 수행할 때 에너지 피크는 매달 변경될 수 있습니다.
26. 다른 모든 매개 변수를 기본값(Isometric voxel 크기: 400mm; 반복 횟수: 30)으로 유지합니다. 에너지 해상도: 30%; 마지막 반복만 저장합니다. 이진 데이터 유지) 을 선택 취소) .
27. 추가를 확인합니다.
    참고: 창이 "재구성이 큐에 추가되고 다른 창이 끝나면 시작됩니다"라는 창이 나타납니다. 확인을 선택합니다. 파일이 재구성 탭의 재구성 목록에 나타나고 상태가 대기 또는 % (진행률) 또는 완료된 것으로 표시됩니다.

4. 이미지 분석

참고: 전용 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지 분석을 수행합니다. 현재 프로토콜에서 데모는 특정 소프트웨어 프로그램을 사용하지만 사용할 수 없는 경우 다른 옵션을 사용할 수 있습니다.

1. 오픈 PMOD > 그것을 융합.
2. 화면 상단의 일치하는 탭으로 이동합니다.
3. 화면 오른쪽 중간에 로드 입력 메뉴를 열고 자동 감지 파일을 선택하고, PET 파일(DICOM, Interfile 또는 NifTI)을 선택하고, 선택한 에 추가하고, 작업으로 클릭하고, 표준 방향에 대한 방향을 조정하고, 로드 및 닫기를 클릭합니다.
4. 동물 종은 화면의 하단에 올바른지 확인(RAT).
5. 화면 오른쪽 하단에 자르기 란을 선택합니다.
6. PET 이미지의 노란색 상자 크기를 조정하여 뇌 전체를 차지합니다.
7. 화면 오른쪽의 강성 버튼을 클릭합니다. 확인 창에서 예.
8. 참조 아틀라스를 엽니 다 화면의 오른쪽 중간에 뇌 도구를 클릭합니다. Px 쥐 (W.Schiffer) 선택 - T2.
9. 오른쪽 상단 탭에서 결과 일치를 선택합니다(처리 단계 탭 선택).
10. 데이터 자료(오른쪽 상단 의^4번째탭)를 클릭합니다.
11. 회전 도구(PET 이미지 중앙의 흰색 아이콘)를 사용하여 PET 이미지를 참조 템플릿과 정렬합니다. 3개의 해부학 용 평면에 대한 정렬을 확인합니다.
12. 공동 등록 파일(화면의 오른쪽 메뉴)을 저장합니다.
13. 출력 형식(DICOMor NifTI), 디렉터리 및 파일 접두사를 선택합니다. 저장을클릭합니다.
    참고: 공동 등록 출력이 NifTi로 저장되면 헤더 이미지 정보가 손실됩니다.
14. 화면 하단의 VOI 메뉴를 클릭합니다.
15. 화면 하단의 템플릿 > 아틀라스(VOIs 창 아래)로 이동합니다.
16. 드롭다운 메뉴에서 Px Rat(W.Schiffer)를 선택합니다.
    참고: 특정 VOI만 분석해야 하는 경우 관심 있는 뇌 영역만 선택할 수 있습니다. 뇌 아틀라스의 모든 뇌 영역을 원한다면 아무런 조치가 필요하지 않습니다.
17. 화면 하단의 윤곽선을 클릭합니다.
    참고: 뇌 영역의 VOI가 VOIs 창에 표시됩니다.
18. 병변 부위 및 모순된 뇌 반구^{영역(각각 11}C-PIB 낮은 섭취량 영역 및 반자 뇌 반구)에서 VOI를 수동으로 그립니다.
19. ¹¹C-PIB 낮은 섭취량으로 PET 이미지 영역을 클릭합니다.
20. 새로운 VOI 를 선택 > 확인.
    참고: 스프레드시트가 나타납니다.
21. 화면 중앙에 있는 SPHERE 아이콘으로 이동(VOIs 창 왼쪽)
    참고: 스프레드시트가 나타납니다.
22. VOI 이름을 선택합니다: 병변 및 적용 을 선택합니다.
    참고: 공동 등록된 이미지에 구가 나타납니다.
23. 병변 영역의 구를 정렬하고 모든 해부학 적 평면에 대한 VOI를 조정합니다.
24. 스프레드시트 의 하단 부분에 닫기(스프레드시트의 하단 부분)를 클릭합니다.
25. 병변 VOI를 선택합니다(VOIs 목록에서).
26. VOI 미러링 작업 아이콘(VOIs 창의 오른쪽 상단)으로 이동하여 복제본을 선택하고 왼쪽/오른쪽 미러를선택합니다.
27. VOI 목록 창 맨 위에 선택한 VOI 통계를 계산하려면 이동합니다. 통계를 선택하여 계산아이콘으로 이동하여 출력 데이터(VOI 통계 아이콘의 오른쪽)를 선택합니다. 일반적으로 myelin 콘텐츠 확인 VOI의 그룹에 대 한 통계, 평균, SD, 최소, 최대).
    참고: 스프레드시트가 나타납니다. 기본 설정 데이터 단위는 kBq/cc입니다. 스프레드시트(VOI 통계)의 왼쪽 상단에는 데이터 단위를 SUV(표준화된 Uptake Value)로 확인할 수 있습니다. 스캐너 소프트웨어에서 방사성 추적기 관리 및 이미지 수집 세부 정보를 올바르게 완료한 경우, 이전에 설명한 대로 SUV 데이터는 PMOD 소프트웨어에 의해 자동으로 계산되며, 그렇지 않은 경우 세부 정보를 편집할 수 있습니다.
28. 시스템 로캘 번호 형식을 사용하여 복사로 이동합니다.
    참고: 출력으로 복사하도록 모든 통계를 선택했는지 확인합니다(화면 오른쪽 상단에 있는 아이콘 확인). 복사될 데이터는 선택한 데이터 단위에 따라 다릅니다.
29. 출력 데이터를 메모장 또는 스프레드시트에 붙여 넣습니다.
    참고: 숫자 간의 도트 및 쉼표 기호에 대한 소프트웨어 설정에 주의하십시오. 언어 구성 간에 다를 수 있습니다.
30. 학습 이름과 세부 정보로 파일을 저장합니다.

결과

그림 1은 시간이 지남에 따라 마일린이 변경된 ^11개의C-PIB PET 이미지를 보여줍니다. 기준 선상 검사에서는 myelin 함량에서 차이를 볼 수 없습니다 (즉, 탈모가 존재하지 않습니다). 1주 시간 점 이미지에서, 흰색 화살표에 의해 표시된 바와 같이 초점 탈밀병병(오른쪽 반구)을 볼 수 있다. 이미지는 3개의 해부학 적인 평면 (관상, 축 및 처질)에 제시되고 그들 모두에 있는...

토론

다발성 경화증을 연구하기 위해 리솔자박 모델을 사용하는 가장 큰 장점은^14에서발생하는 탈민화(약 1주)와 재마일레네이션(약 4주)에 대한 빠른 타임라인이다. 이 모델은 또한^{마우스(15)에서}유도될 수 있지만, 쥐의 유도는 쥐에 비해 쥐 뇌의 큰 크기로 인해 생체 내 PET 이미징에 더 유리하다.

유도 모델의 첫 번째 단계는 매우 신중해?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytical Balance	Marte	AUWZZOD	max: 220 g- min: 1 mg
Anestesia vaporizer	Nanitech	15800
Beta-cube	Molecubes
Bulldog clamp	Stoelting	5212043P
clorexidine	Rioquimica		0.5%/100 mL
Cotton swabs	johnson e johnson
Dose calibrator	Capintech
Drill	Kinzo powertools	352901	Model Q0M-DC3C
Eppendorf tube	Eppendorf	30125150	1.5 mL
Eye lubricant	ADVFARMA	30049099	vaseline 15 g (pharmaceutical purity)
Fine forceps	Stoelting	52102-38P
Gloves	Descarpack	212101	6.5 size
Heating pad	Softhear
Injection Syringe	Hamilton	80314	10µ, 32ga, model 701
Insuline syringe	BD	328328	1 mL insulin syringes with needle
Isoflurane	Cristália	410525	100 mL , concentration 1 mL/1 mL
Ketoprofen or other analgesic	Sanofi		100 mg/2 mL
lidocaine	Hipolabor	1.1343.0102.001-5	2%/20mL
L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk	Sigma-aldrich	L-4129	25 mg - ≥99%, Type I, powder
Needle holder	Stoelting	5212290P
Oxygen	White Martins	7782-44-7	Compressed gas
PMOD software	PMOD technologies	Version 4.1	module fuse it
Rat anesthesia mask	KOPF	Model 906
Saline	Farmace	0543325/ 14-8	0.9% sodium chloride for injection, 10 mL
Scapel blades	Stoelting	52173-10
Scapel handles	Stoelting	52171P
Scissor	Stoelting	52136-50P
Semi-analytical Balance	Quimis	BK-3000	max:3,100 g; min:0.2 g
shaver	Mega profissional		AT200 model
Stereotactic Apparatus	KOPF	Nodel 900
Universal holder with needle support	KOPF	Model 1772-F1	Hamilton support for 5 and 10 µL