Позитронная эмиссионная томография для измерения содержания миелина в модели крысы лизолецитина рассеянного склероза

Резюме

Этот протокол имеет целью мониторинг изменений in vivo myelin (демиелинизация и ремиелинизация) с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) в животной модели рассеянного склероза.

Аннотация

Рассеянный склероз (MS) является нейровоспалительным заболеванием с расширением аксональной и нейрональной дегенерации и демиелинизации в центральной нервной системе, что приводит к двигательным дисфункциям, психическим нарушениям и когнитивным нарушениям во время прогрессирования MS. Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) — это метод визуализации, способный количественно давать количественную оценку клеточным и молекулярным изменениям in vivo.

Радиотрактеры с сродством к нетронутой миелин может быть использован для in vivo изображения миелина изменения содержания с течением времени. Можно обнаружить либо увеличение или уменьшение содержания миелина, что означает, что этот метод визуализации может обнаружить демиелинизации и ремиелинизации процессов центральной нервной системы. В этом протоколе мы демонстрируем, как использовать ПЭТ-изображения для обнаружения изменений миелина в модели крысы лизолецитина, которая является моделью поражения очаговой демиелинизации (индуцированной стереотаксической инъекцией) (т.е. модель болезни рассеянного склероза). ^{11 Лет} C-PIB ПЭТ-изображение было выполнено на базовом уровне, и через 1 неделю и 4 недели после стереотаксиса инъекции лизолецитина 1% в правом стриатуме (4 МКЛ) и корпусе каллосума (3 МКЛ) крысиного мозга, что позволяет количественно определить очаговую демиелинизацию (место инъекции после 1 недели) и процесс ремиелинизации (место инъекции в течение 4 недель).

Миелин ПЭТ-изображения является интересным инструментом для мониторинга in vivo изменения содержания миелина, которые могут быть полезны для мониторинга демиелинизирующих прогрессии заболевания и терапевтической реакции.

Введение

Рассеянный склероз (MS) является нейровоспалительным заболеванием, которое влияет на центральную нервную систему, характеризуется воспалением, демиелинизацией и аксональной^{потерей 1}. Прогноз этого заболевания является переменной даже с достижениями в лечении, и это одна из наиболее распространенных причин неврологического дефицита у молодых людей¹. Диагноз MS основан на критериях клинического проявления и визуализации характерных поражений магнитно-резонансной томографией^{(МРТ) 2,3.}

Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) может быть полезным инструментом для виво мониторинга прогрессирования РС и терапевтических эффектов. Питтсбург соединения B radiotracer (PIB) помечены углерода-11 (¹¹C-PIB) широко используется для количественной оценки β-амилоидных бляшек; однако, в последнее десятилетие, было изучено для количественной оценки содержания миелина и показать динамическую демиелинизацию^{и ремиелинизацию 4,5,6}.

Различные амилоидные ПЭТ трассировщики (¹¹C-PIB, ¹⁸F-florbetaben,¹⁸F-florbetapir, ¹⁸F-flutemetamol) могут быть использованы для количественной оценки миелина и предоставить важную информацию о прогрессировании заболевания и терапевтической реакции, что позволяет идентифицировать демиелинизации^{и ремиелинизации процессов, без вмешательства нейровоспаления, которые могут произойти с обычными магнитно-резонансных изображений}(МРТ) 7. Амилоид ПЭТ визуализации показали снижение поглощения трассировщика у активных пациентов MS по сравнению с неигровых пациентов, которые могут быть объяснены ранним повреждением белого вещества у активных^{пациентов 8}. Нижний амилоидный трассировщик поглощения также был связан с когнитивным снижением в последующем исследовании, показывая этот метод, чтобы быть ценным инструментом для изучения патофизиологии болезни и клинических^{исходов 9}.

Модель крысы лизолецитина (LPC) является химической индуцированной моделью рассеянного склероза, где инъекционный токсин, LPC, вызывает высокую реакцию макрофагов, что приводит к увеличению воспаления и, следовательно, демиелинизации^10,11. Демиелинизация быстро меняется примерно через 4 недели, что делает эту модель хорошей моделью для оценки процессов демиелинизации и ремиелинизации у грызунов. Эта модель уже была оценена с помощью ПЭТ-изображения, с хорошими результатами и корреляцией с посмертным эссе¹².

Здесь мы представляем протокол для миелин ^{ПЭТ-изображения с 11}C-PIB в модели крысы лизолецитина, показывая этот метод изображения, чтобы быть полезным инструментом для измерения in vivo содержания миелина.

протокол

Все процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами Национального совета по контролю за экспериментами на животных (CONCEA, Бразилия) и были одобрены Комитетом по этике по исследованиям животных Медицинской школы Университета Сан-Паулу (CEUA-FMUSP, Бразилия - протокол номер: 25/15).

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе, мы показываем, как вызвать лизолецитин крысы модель рассеянного склероза и как приобрести и проанализировать миелин ПЭТ изображения.

1. Препарат раствора лизолецитина

1. Взвешивание лизолецитина (L-α-Lysophosphatidylcholine из яичного желтка) в аналитическом масштабе с использованием конической пластиковой трубки (1,5 мл).
2. Добавить стерильный солевой раствор в трубку, чтобы сделать 1% раствор (например: вес 1 мг лизолецитина и растворить его с 100 л солевого раствора) и растворить лизолецитин, встряхивая трубку (встряхивая из стороны в сторону и не поворачивая сверху вниз).
3. Подготовьте раствор прямо перед запуском индукции модели животного (не запаситесь окончательным готовым раствором).

2. Модель крысы лизолецитина - Стереотаксисная хирургия

1. Используйте самцов крыс Wistar весом от 220 до 270 г. Используйте перчатки и маску во время всех процедур.
2. Индуцировать анестезию с 5% изофлюраном, смешанным в 100% O₂ (1 л/мин) с помощью индукционной коробки. Проверьте, является ли животное анестезировано при наблюдении за отсутствием движения (следует наблюдать только дыхание).
3. Поместите животное в стереотаксисный аппарат на грелку. Зафиксив нос и уши животного на оборудовании.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о том, как выполнить стереотаксис хирургии можно найти в JoVE науки образования базы данных. Неврология. Стереотаксис грызунов. JoVE, Кембридж, Массачусетс, 2021.
   1. Мониторинг анестезии в течение всей процедуры (включая операцию и приобретение изображений). Чтобы скорректировать концентрацию изофлюрана, наблюдайте за скоростью дыхания животных. Быстрая скорость дыхания требует более высокой концентрации, а медленная частота дыхания требует более низкой анестезии.
4. Вводят обезболивающее (кетопрофен - 5 мг/кг) подкожно (разбавляют препарат до 1 мл солевым раствором, это поможет увлажнить животное).
5. Положите крем для глаз в глаза животного, чтобы защитить от обезвоживания.
6. Используйте 0,5% хлоргексидина раствор для очистки области разреза.
7. Ввпрыснуть 100 МКЛ лидокаина гидрохлорида 2% подкожно в области разреза.
8. Бритье области черепа.
9. Используйте стерильные инструменты для этой процедуры.
10. Используя скальпель, сделайте разрез около 2 см кожи над черепом.
11. Разоблачить череп с бульдогом зажимы.
12. Используйте тампон для очистки области черепа с 1% пероксидазы водорода.
13. Найдите и отметте брегму (стереотаксис атлас мозга крысы может помочь тождестветь Bregma).
14. Распоистите шприц Гамильтона (шприцы неврозов) на брегме.
15. Используя брегму и стереотаксисный атлас в качестве эталона, располагайте шприц Гамильтона по следующим координатам: Antero-posterior: -0,30 мм, боковой- боковой: -3,0 мм, и брюшной, пока он не коснется кости черепа, и отметьте череп и обратите внимание на координаты ориентации на бумаге.
16. Просверлите череп на маркированную координату. Позаботьтесь с dura mater (повреждение dura mater может вызвать много кровотечений).
17. Заполните шприц Гамильтона 7 МЛ раствора лизолецитина (1% в солевом растворе). В шприц можно поместить больший объем, но вводить только 7 МКЛ (вывести пузырьки из шприца для правильного измерения объема).
18. Распоитите шприц Гамильтона в предыдущих координатах, чтобы начать инъекцию препарата (всего 7 мкл в 3 различных желудочковых стереотаксических координат). Учитывая ранее отмеченные координаты, опустите шприц Гамильтона до брюшной координаты -5,0 мм.
19. Очень медленно вводят 2 МКЛ раствора лизолецитина (1 йл/10 мин). Подождите 3 мин.
20. Возьмите иглу до следующей вентраальной стереотаксисной координаты (-4,2 мм) и медленно ввишите 2 мл раствора лизолецитина (1 йл/ 10 мин). Подождите 3 мин.
21. Ввишите третью вентрал-координату -3,0 мм (3 мкл раствора лизолецитина - 1 мл/10 мин).
22. Подождите 5 минут, а затем удалить шприц Гамильтона из мозга.
23. Шов кожи.
24. Удалите животное из стереотаксического аппарата и дайте животному пробудиться.
25. Вернуть животное в домашнюю клетку, держать животное в покое и под наблюдением, чтобы проверить признаки дискомфорта.
26. Вводят подкожный анальгет (кетопрофен - 5 мг/кг), разбавленный солевым раствором, при 24 ч и 48 ч после операции.

3. Приобретение ПЭТ

1. Возьмите от 7 до 20 MBq ¹¹C-PIB радиоактивности в шприце (1 мл является максимальным объемом, допустимым для внутривенных инъекций у крыс).
2. Анестезировать животное с 5% изофлюран смешивается в 100% O₂ (1 л / мин) с помощью индукционной коробки.
3. Инъекция ¹¹C-PIB (радиоактивность, определенная в пункте 4.1 выше) в вену полового члена, или хвостовую вену крысы (оба административных участка в порядке, решение является личным выбором. Мы только советуем не использовать ретро-орбитальную инъекцию, так как расположение слишком близко к области интереса (мозг) и может ухудшить качество изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение приобретения базовой точки времени выполняется до стереотаксисных инъекций, а остальные 2 точки времени на 1 неделю и 4 недели после операции.
4. Удалите животное из наркоза, чтобы животное пробудилось (оставьте животное на теплой площадке, пока оно полностью не проснется).
5. Верните животное в домашнюю клетку.
6. Подождите 30 минут для следующего шага.
7. Обезболивать крыс с 5% изофлюран смешивается в 100% O₂ (1 л / мин) с помощью индукционной коробки.
8. Открытое программное обеспечение ПЭТ сканера.
9. Выберите Сканирование и Pet Готов.
10. Полный главный исследователь детали, исследование ID, серия ID, животных ID, вес животных (г), и дополнительные заметки. Выберите следующий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте точку (.) для десятичного числа в весе животного.
11. Редактировать roi области для сканирования (обычно между 3 и 8). Это область, которая будет включена в изображение (области между числами 3 и 8 крышки кровати появится в окончательном изображении).
12. Распоить анестезированую крысу на стандартной крысиной ложе ПЭТ-сканера и включить анестезию (3% изофлюран в 100% O_{2 является} хорошим началом, а затем скорость анестезии должна быть скорректирована по мере необходимости). Чтобы настроить анестезию, проверьте данные мониторинга программного обеспечения сканера, чтобы убедиться, что животное дышит в постоянном и медленном ритме.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Включите вакуумный насос в сочетании с активированным углеродным фильтром для сбора избытка газа изофлюран (если насос доступен).
13. Нанесите крем для глаз, чтобы защитить глаза животного.
14. Нажмите кровать животного внутри ПЭТ сканера.
15. Полная информация о деятельности, время калибровки активности, Изотоп (C-11) и продолжительность сканирования (20 минут). Выберите начало сканирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сообщение Pet Moving Bed появится, и животное кровать будет двигаться в оборудование и остановиться на ранее выбранной позиции рентабельности инвестиций. Время приобретения начнется отсчет и количество подсчетов в секунду появится (CPS).
16. В программном обеспечении сканера перейдите на вкладку Monitor слева от экрана, проверьте порог изменения дыхательных параметров (BPM).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окно всплывает, в комплекте с параметром порога (500). Выберите OK.
17. Перейдите на 0% POWER, чтобы изменить параметры температуры, чтобы нагреть животное во время сканирования. Окно всплывает; завершить параметр (80 - 100). Выберите OK.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте от 80 до 100% мощности в зависимости от условий комнатной температуры (чем больше мощности, тем теплее она будет получать).
18. Перейдите на вкладку SCAN.
19. Перейдите к инструменту конфигурации (значок передач) и завершите время впрыска, оставшуюся активность, оставшееся время калибровки активности. Выберите Сохранить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всплывающее окно "Вы уверены, что хотите изменить метаданные протокола?" Да, ДА
20. Перейдите обратно на вкладку Monitor (проверьте дыхательные параметры животного, а при необходимости увеличьте или уменьшите концентрацию изофлюрана - обычно достаточно 3% в 100% O_2).
21. Когда приобретение ПЭТ будет закончено, сообщение Pet Ready появится на вкладке Scan, проверьте Arrow Out Icon (слева от инструмента конфигурации), чтобы выйти из кровати животного.
22. Снимите животное с наркоза и дайте пробудиться на теплой площадке.
23. Для восстановления изображения перейдитена вкладку «Реконструкция».
24. Проверьте плюс значок в левом нижнем углу экрана и выберите файл исследования, который будет реконструирован. Выберите следующий.
25. Перейдите к инструменту разрешения энергии. Окно всплывает. Настройте энергетический пик (keV) на параметр оборудования (на основе ежемесячного контроля качества). Выберите Закрыть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Энергетический пик может меняться каждый месяц при выполнении ежемесячной калибровки оборудования.
26. Держите все остальные параметры по умолчанию (размер изометрического воксела: 400 мм; количество итераций: 30; Разрешение энергии: 30%; Сохранить только последнюю итерацию; uncheck Храните двоичные данные) .
27. Проверить Добавить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всплывающее окно "Реконструкция была добавлена в очередь и начнется, как только другие закончили". Выберите OK. Файл появится в списке реконструкций на вкладке «Реконструкция», и статус будет отображаться как ожидание или % (прогресс) или законченный.

4. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните анализ изображений с помощью специального программного обеспечения для анализа изображений. В текущем протоколе демонстрация использует определенную программу, но если она недоступна, могут быть использованы другие варианты.

1. Открыть PMOD и предохранитель его.
2. Перейдите на вкладку Соответствие в верхней части экрана.
3. Откройте меню Load Input в правой середине экрана и выберите файлы Autodetect, выберите ФАЙЛ PET (DICOM, Interfile или NifTI), добавьте к выбранному, нажмите кнопку Operations, переориентуйте на стандартную ориентацию, нажмите Load и Close.
4. Проверить, правильно ли животное видов в нижней части экрана (RAT).
5. Проверьте поле урожая в правом нижнем углу экрана.
6. Отрегулируйте размер желтой коробки на ПЭТ-изображении, чтобы взять весь мозг.
7. Нажмите кнопку Rigid справа от экрана. При подтверждении окна нажмите Да.
8. Нажмите на инструмент мозга в правой середине экрана, чтобы открыть справочный атлас. Выберите Px Крыса (W.Schiffer) - T2.
9. Выберите результаты матча из первой правой вкладки (Выберите вкладку этапа обработки).
10. Нажмите на ре нарезку данных (4-я^{вкладка}в правом верхнем меню).
11. Выравнивание ПЭТ-изображения с эталоном шаблона с помощью инструмента вращения (белый значок в центре ИЗОБРАЖЕНИЯ ПЭТ). Проверьте выравнивание для 3 анатомических плоскостей.
12. Сохраните файл совместной регистрации (правое боковое меню экрана).
13. Выберите формат вывода (DICOMor NifTI), каталог и приставку к файлу. Нажмите Сохранить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если совместно зарегистрированный выход сохраняется как NifTi, информация об изображении заголовка будет потеряна.
14. Нажмите меню VOIs в нижней части экрана.
15. Перейдите на шаблон «Gt; Atlas» в нижней части экрана (ниже окна VOIs).
16. Выберите Px Rat (W.Schiffer) из выпадают из меню.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если вам нужно проанализировать только конкретные VOIs вы можете выбрать только области мозга, представляющие интерес. Если вы хотите, чтобы все области мозга атласа мозга, никаких действий не требуется.
17. Нажмите Outline в нижней части экрана.
    ПРИМЕЧАНИЕ: VOIs областей мозга появится в окне VOIs.
18. Вручную нарисуйте VOI в месте поражения и контралатеральной области полушария мозга⁽¹¹C-PIB низкой области поглощения и контралатерального полушария мозга, соответственно).
19. Нажмите в области ПЭТ-изображения с ¹¹C-PIB низким поглощением.
20. Выберите Новый VOI и OK.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Появится электронная таблица
21. Перейдите к значку SPHERE в средней части экрана (слева от окна VOIs)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Появится электронная таблица.
22. Выберите имя VOI: поражение и выберите Применить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сфера появится на со-зарегистрированном изображении.
23. Выровнять сферу в области поражения и настроить VOI для всех анатомических плоскостей.
24. Нажмите Закрыть (в нижней части таблицы).
25. Выберите поражение VOI (из списка VOIs).
26. Перейдите на значок зеркальных операций VOI (в правом верхнем справа от окна VOIs) и выберите клон и зеркало влево/вправо.
27. Перейдите для расчета выбранной статистики VOI в верхней части окна списка VOIs. Перейдите к выберите статистику для расчета значка для выбора выходных данных (в правую сторону значка статистики VOI). Обычно для миелина проверка содержания Статистика для группы VOIs, Средний, SD, Мин, Макс).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Появится электронная таблица. Установка данных по умолчанию kBq/cc. В левой верхней части таблицы (СТАТИСТИКА VOI) вы можете проверить единицу данных как внедорожник (Стандартизированное значение поглощения). Если вы завершили администрирование радиотрасера и данные о приобретении изображений правильно в программном обеспечении сканера, как описано ранее, данные внедорожника будут рассчитываться автоматически программным обеспечением PMOD, если нет, вы можете редактировать детали.
28. Перейдите на copy с помощью формата номеров системного лока.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте, выбраны ли все статистические данные для копирования в качестве вывода (Проверить значок в правой верхней части экрана). Данные, которые будут скопированы, зависят от выбранной Группы данных.
29. Вставьте выходные данные в блокнот или электронную таблицу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о настройках программного обеспечения для точечных и запятых символов между числами. Это может отличаться между конфигурациями языков.
30. Сохраните файл с именем исследования и деталями.

Результаты

На рисунке 1 показаны ^{иллюстративные 11}C-PIB ПЭТ-изображения с изменениями миелина с течением времени. В базовом сканировании нет различий в содержании миелина (т.е. демиелинизации нет). На 1-недельном изображении можно увидеть очаговое демиелинетное поражение (в прав...

Обсуждение

Самым большим преимуществом использования модели лизолецитина для изучения рассеянного склероза является быстрая шкала времени демиелинизации (около 1 недели) и ремиелинизации (около 4 недель)^{происходит 14}. Эта модель также может быть индуцирована^{у мышей 15}, од...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytical Balance	Marte	AUWZZOD	max: 220 g- min: 1 mg
Anestesia vaporizer	Nanitech	15800
Beta-cube	Molecubes
Bulldog clamp	Stoelting	5212043P
clorexidine	Rioquimica		0.5%/100 mL
Cotton swabs	johnson e johnson
Dose calibrator	Capintech
Drill	Kinzo powertools	352901	Model Q0M-DC3C
Eppendorf tube	Eppendorf	30125150	1.5 mL
Eye lubricant	ADVFARMA	30049099	vaseline 15 g (pharmaceutical purity)
Fine forceps	Stoelting	52102-38P
Gloves	Descarpack	212101	6.5 size
Heating pad	Softhear
Injection Syringe	Hamilton	80314	10µ, 32ga, model 701
Insuline syringe	BD	328328	1 mL insulin syringes with needle
Isoflurane	Cristália	410525	100 mL , concentration 1 mL/1 mL
Ketoprofen or other analgesic	Sanofi		100 mg/2 mL
lidocaine	Hipolabor	1.1343.0102.001-5	2%/20mL
L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk	Sigma-aldrich	L-4129	25 mg - ≥99%, Type I, powder
Needle holder	Stoelting	5212290P
Oxygen	White Martins	7782-44-7	Compressed gas
PMOD software	PMOD technologies	Version 4.1	module fuse it
Rat anesthesia mask	KOPF	Model 906
Saline	Farmace	0543325/ 14-8	0.9% sodium chloride for injection, 10 mL
Scapel blades	Stoelting	52173-10
Scapel handles	Stoelting	52171P
Scissor	Stoelting	52136-50P
Semi-analytical Balance	Quimis	BK-3000	max:3,100 g; min:0.2 g
shaver	Mega profissional		AT200 model
Stereotactic Apparatus	KOPF	Nodel 900
Universal holder with needle support	KOPF	Model 1772-F1	Hamilton support for 5 and 10 µL