Bioluminescente Optogenética 2.0: Aproveitamento da Bioluminescência para Ativar Proteínas Fotosensory In Vitro e In Vivo

Resumo

A luz de bioluminescência emitida por uma enzima luciferase oxidando um substrato de molécula pequena, uma luciferina pode ser aproveitada para ativar proteínas fotosensoriais, adicionando assim outra dimensão à estimulação da luz e permitindo a manipulação de uma infinidade de funções mediadas pela luz em células através de escalas temporais e espaciais.

Resumo

A bioluminescência - luz emitida por uma enzima luciferase oxidando um substrato de molécula pequena, uma luciferina - tem sido usada in vitro e in vivo para ativar canais de íons e bombas de íons com entrada de luz em neurônios. Embora essa abordagem bioluminescente optogenética (BL-OG) confere um componente quimigenético às ferramentas optogenéticas, não se limita ao uso na neurociência. Em vez disso, a bioluminescência pode ser aproveitada para ativar qualquer proteína fotossensorial, permitindo assim a manipulação de uma infinidade de funções mediadas pela luz nas células. Uma variedade de pares de luciferase-luciferina pode ser combinada com proteínas fotossensoriais que requerem diferentes comprimentos de onda de intensidades de luz e luz.

Dependendo da aplicação específica, a entrega de luz eficiente pode ser alcançada usando proteínas de fusão de fotorreceptores de luciferase ou por co-transfecção simples. Proteínas fotossoriais baseadas em dimerização dependente da luz ou alterações conformais podem ser impulsionadas pela bioluminescência para efetivar processos celulares desde a localização de proteínas, regulação de vias de sinalização intracelulares até a transcrição. O protocolo abaixo detalha a execução experimental da ativação da bioluminescência em células e organismos e descreve os resultados usando recombinases orientadas por bioluminescência e fatores de transcrição. O protocolo fornece aos investigadores os procedimentos básicos para a realização de optogenética bioluminescente in vitro e in vivo. As abordagens descritas podem ser ainda mais estendidas e individualizadas para uma infinidade de diferentes paradigmas experimentais.

Introdução

Proteínas fotossensoriais podem ser ativadas pela luz de uma fonte de luz física ou de uma enzima luciferase na presença de seu substrato, a luciferina, para gerar bioluminescência. Para aplicações que requerem escalas de tempo mili ou mesmo femtosegundos e/ou resolução espacial unicelular, as fontes de luz física (lasers e diodos emissores de luz (LEDs)) são as únicas incapazes dessas escalas. Exemplos são a restrição espacial da luz usada para estimular polos opostos no desenvolvimento de larvas de Drosophila com controle temporal milissegundo1 ou a estimulação precisa de estruturas subcelulares únicas, como túbulos mitocondriais2. No entanto, muitas outras aplicações para switches ópticos têm prioridades diferentes, incluindo controle espacial estendido e aplicação repetida não invasiva e sem dano à luz, mas com controle temporal definido em escalas de tempo minúsculas e intensidades tunable. Aqui, usar as luciferases como fonte de luz alternativa para ativar domínios de sensor de luz tem várias vantagens. Em contraste com a ativação da luz de fibra óptica, a bioluminescência atinge todos os domínios de sensoriamento de luz expressos na população celular-alvo à medida que a fonte de luz é geneticamente codificada. O uso da bioluminescência alivia as preocupações com os danos teciduais e celulares por fibra óptica e exposição prolongada à luz física. A luz é acesa com a aplicação do substrato luciferase. O início é imediato in vitro e in vivo dependendo da rota da administração e dura ~15-30 min; presença estendida ou estimulação afásica de luz pode ser alcançada com diferentes luciferinas e com aplicações adicionais ou repetidas de ^substrato3. Por fim, a emissão de bioluminescência pode ser ajustada variando a concentração de luciferina.

O uso de bioluminescência para ativar fotorreceptores em movimento de íons, ou seja, elementos optogenéticos, como channelrhodopsins ou bombas, tem sido amplamente demonstrado4,5,6,7,8. Esta abordagem BioLuminescente OptoGenetics (BL-OG) tem sido empregada em experimentos in vivo em camundongos e ratos5,6,7,9,10,11,12. A ativação bl-OG de opsinas exigiu uma quantidade de bioluminescência de pelo menos ~33 μW/^mm2, com a eficiência da ativação aumentando com maior emissão de ^luz6,9. Fotorreceptores sensoriais em movimento de íons são um subgrupo do grande contingente de fotorreceptores sensoriais encontrados na natureza que não são ion ^movendo13,14. A extensão da bioluminescência para ativar fotorreceptores móveis não-íons, como o fotosensing de domínios de plantas ou bactérias, é incentivada por ^{relatórios15,16} de que fotosensores móveis não-íons são significativamente mais sensíveis à luz do que os canalrhodopsinas, garantindo um impulso ainda melhor de sensores de luz com bioluminescência do que já obtidos com elementos optogenéticos em movimento de íons. Recentemente, várias publicações relataram o uso da bioluminescência como fonte de luz para a ativação de uma variedade de fotorreceptores, incluindo domínios de sensoriamento de temporais de luz-oxigênio (LOV), domínios de blue-light-using-flavin (BLUF) e criptocromos (CRYs)3,17,18,19,20,21,22 (Tabela 1 ). Aplicações para ativação orientada à bioluminescência de switches ópticos direcionadas a processos intracelulares que vão desde morte celular induzida por espécies de oxigênio reativo, síntese cAMP, recrutamento e dissociação de proteínas até recombinação genômica e indução da transcrição.

Este protocolo descreve o desenho geral de ferramentas optogenéticas orientadas à bioluminescência e detalha os procedimentos para a execução experimental da ativação da bioluminescência em células e organismos. Inclui descrições sobre como montar uma sala, uma capa de cultura de tecido e incubadora, e um microscópio para trabalhar com bioluminescência, bem como os passos de preparar a luciferina para aplicá-la. Este protocolo fornece aos pesquisadores os procedimentos básicos para a realização de BioLuminescente OptoGenetics (BL-OG) in vitro e in vivo. As abordagens descritas podem ser ainda mais estendidas e individualizadas a diferentes paradigmas experimentais. Antecipamos esse protocolo para facilitar a adoção do uso da bioluminescência em estudos biológicos optogenéticos.

Protocolo

Todos os procedimentos do presente estudo foram realizados utilizando protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) para manejo de animais na Universidade Central de Michigan, MI.

1. Ativação de bioluminescência de proteínas fotosensory in vitro

1. Constrói
   1. Selecione uma sequência de luciferase ou uma sequência de fusão de proteínas fluorescentes de luciferase que resultará na expressão de um emissor de luz produzindo luz de um comprimento de onda que corresponde ao fotoreceptor a ser ativado.
      NOTA: Por exemplo, as luciferases emissoras de luz azul, como variantes de luciferase gaussia ou NanoLuc, podem ser emparelhadas com fotorreceptores de sensor de luz azul, como CRY/^Ca2+- e proteína de ligação de integrin (CIB), LOV ou Vivid (VVD).
   2. Se ainda não estiver disponível de outros investigadores ou depósitos de plasmídeos, use técnicas padrão de biologia molecular para clonar o DNA em uma expressão de mamífero plasmídeo.
      NOTA: A escolha dos promotores é ditada pela necessidade de proporcionar uma expressão forte e constitutiva do módulo emissor de luz, como o fornecido pelos promotores do CAG e CMV.
   3. Para estudos iniciais, use plasmídeos separados para a co-transfecção do emissor de luz e do sensor de luz. Gerar proteínas de fusão dos dois moieties conforme necessário e para estudos subsequentes.
   4. Obtenha DNAs plasmídeos de alta qualidade usando kits mini-, midi-ou maxiprep de acordo com os protocolos do fabricante.
2. Cultura celular e transfecção
   NOTA: As células HeLa e HEK293 são usadas como exemplos neste protocolo.
   1. Células de placa em formatos e números de acordo com o uso final desejado.
      NOTA: Exemplos específicos são dados na Tabela 2. A densidade celular no momento do revestimento determinará em quanto tempo as células podem ser transfeccionadas.
      1. Para avaliar a transcrição ativada pela bioluminescência por microscopia de fluorescência, as células hek293 da placa hek293 em poli-D-lysina (PDL) revestidas de 12 mm de tampas colocadas em pratos de 24 poços.
      2. Para avaliar a transcrição ativada pela bioluminescência medindo a emissão de luz de uma luciferase de repórter ortogonal em um luminômetro, as células de placa HeLa inicialmente em pratos de 6 ou 12 poços para transfecção, mas re-emplacam-nas após a transfecção (ver passo 4).
      3. Se a estimulação repetida de bioluminescência for realizada em câmaras de imagem de células vivas, selecione clipes de cobertura do tamanho apropriado e coloque-os em placas multi-poço do tamanho apropriado (placas de 24 poços para tampas de 12 mm; placas de 12 poços para tampas de 15 mm e 18 mm). Semear as células em cima das tampas usando os números de células especificados na Tabela 2. Se o tipo de célula selecionada não aderir bem à superfície da cultura, emplaque as células em pratos revestidos de PDL.
   2. Realizar a transfecção por lipofecção de acordo com a recomendação do fabricante ou utilizar qualquer método de transfecção apropriado para o tipo de célula selecionada.
      NOTA: A Tabela 3 detalha experimentos de transfecção para dois fotorreceptores diferentes, EL222 e CRY2/CIB, e seus respectivos plasmídeos repórteres, além de diferentes proteínas emissoras de luz. As proporções dos vários plasmídeos funcionam bem para os exemplos selecionados, mas terão que ser otimizadas para cada par de sensores de luz/luz.
   3. Após a transfecção, coloque as células em uma incubadora completamente selada (Figura 1).
   4. Dependendo do uso final desejado, use as células para estimulação de bioluminescência no dia seguinte em seus poços/pratos originais, ou reemplaque-os 3-4 h após a lipofecção. Para ler a transcrição de um gene repórter de luciferase vagalume em um luminômetro, re-emplaque as células em placas brancas de 96 poços.
      NOTA: Realize todas as manipulações em uma sala leve em um capô de fluxo laminar iluminado pela luz vermelha (Figura 2).
      1. Lave as células transfeminadas uma vez com o meio eagle modificado (DMEM) modificado de Dulbecco ou soro fisco tamponado (PBS).
      2. Adicione o volume mínimo de um reagente trypsinizador aos poços (24-well: 100 μL; 12-well: 150 μL; 6-well: 300 μL) e incubar as células por 3 min a 37 °C.
      3. Adicione meio de cultura para alcançar uma concentração celular que irá produzir a densidade celular apropriada para o próximo passo de chapeamento (por exemplo, resuspend células em um 24-well em um volume final de 1,2 mL para chapeamento em 10 poços de uma placa de 96 poços; células resuspend em um 12-well em um volume final de 2,4 mL para chapeamento em 20 poços de uma placa de 96 poços). Acumule as células transfectadas de vários poços, dependendo do número de poços necessários no final.
      4. Aplaque as células transfeinadas em seu formato final e devolva as placas à incubadora protegida pela luz.
3. Ativação da bioluminescência in vitro
   1. Prepare o substrato de luciferase (luciferina).
      1. Prepare 50 mM de estoque dissolvendo 5 mg de coelenterazina liofilizada (CTZ) em 250 μL de seu solvente específico. Certifique-se de que todo o CTZ ao longo das paredes do frasco seja dissolvido por pipetação ou vórtice. Proteja o frasco da luz direta.
      2. Prepare 50 alíquotas de μL em tubos de microcentrifusagem preto de 0,5 mL e armazene a -80 °C para uso futuro.
         NOTA: CTZ dissolvido em solvente não congela a -80 °C. As alíquotas podem ser removidas e devolvidas ao congelador várias vezes para fazer soluções de trabalho, desde que a exposição à luz e à temperatura ambiente seja mantida ao mínimo.
   2. Estimulação da luz de bioluminescência única
      NOTA: Todas as manipulações são realizadas em uma sala leve em um capô de fluxo laminar iluminado pela luz vermelha (Figura 2).
      1. Prepare uma solução de trabalho de luciferina no meio de cultura celular (DMEM ou NeuroBasal). Ajuste a concentração da luciferina de tal forma que a concentração final seja de 100 μM. Prepare todas as diluições de CTZ em médio pouco antes de adicionar às células, pois o CTZ oxida ao longo do tempo.
         NOTA: Se todo o volume do meio for substituído, a solução de trabalho será de 100 μM. Se o meio contendo luciferina for adicionado às células, a concentração será maior pelo fator de diluição (por exemplo, adicionando 50 μL de meio contendo luciferina de 300 μM a 100 μL de média no poço resultará em uma diluição de 1:3 e, portanto, em uma concentração final de 100 μM de luciferina).
      2. Adicione o meio contendo luciferina às células e incubar para a duração desejada da estimulação da luz.
         NOTA: Pode ser tão curto quanto 1 min ou até 15 min e pode ser ainda mais curto ou mais longo. O tempo para deixar o meio contendo luciferina nas células depende da meia-vida e cinética da combinação luciferase-luciferina selecionada.
      3. Monitore a emissão de luz a 100 μM de concentração final de luciferina olho após desligar a luz vermelha; esperar por alguns segundos até que os olhos se ajustem para a escuridão completa. Documente a emissão de luz tirando uma foto (mesmo com um celular).
      4. Termine a estimulação da luz removendo o meio contendo luciferina e substituindo-o por meio de cultura. Dependendo da sensibilidade dos experimentos, lave as células com meio de cultura uma ou duas vezes após a remoção do meio contendo luciferina para eliminar toda a luciferina. Se as células não aderirem bem à superfície da cultura, emplaque-as em pratos revestidos de PDL para evitar perder as células durante as lavagens.
      5. Devolva as células à incubadora protegida pela luz por 16-24 h.
   3. Estimulação repetida da luz da bioluminescência
      NOTA: Todas as manipulações são realizadas em uma sala que pode ser feita levemente apertada e ser iluminada pela luz vermelha.
      1. Configure a câmara de imagens de células vivas. Crie um compartimento leve ao redor do microscópio de imagem de células vivas usando uma caixa e folhas de plástico pretas ou cortinas pretas (Figura 3). Cubra todas as fontes de luz presentes dentro do compartimento de luz e da sala (por exemplo, indicadores LED no microscópio ou instrumentos).
      2. Configure o sistema de perfusão com a solução desejada para a entrada e o porto de câmara levando a um recipiente de resíduos.
         NOTA: Por exemplo, a solução de imagem pode ser a Solução de Tyrode (cloreto de sódio (124 mM), cloreto de potássio (3 mM), HEPES (10 mM), dihidrato de cloreto de cálcio (2 mM), hexahidrato de cloreto de magnésio (1 mM), D-glicose (20 mM)).
      3. Prepare uma solução de trabalho de luciferina na solução de imagem. Alíquotar em tantos tubos de microcentrifuuuagem quanto o número de estimulações repetidas. Ajuste a concentração da luciferina de tal forma que a concentração final na câmara de imagem seja de 100 μM.
      4. Coloque uma mancha de cobertura com células transfeinadas na câmara.
      5. Mantendo a bomba funcionando, remova o tubo de entrada da bomba do béquer de entrada e mergulhe-o rapidamente na solução de luciferina, mantendo o tempo de transição o mais curto possível para evitar qualquer vazio de ar na tubulação.
      6. Assim que a solução de luciferina for retomada, coloque o tubo de entrada de volta no béquer de entrada. Repita esse processo quantas vezes for necessário e em intervalos de vários minutos a horas, dependendo do padrão fisiológico ao qual as células devem ser expostas.
      7. Devolva as células à incubadora protegida pela luz por 16-24 h para transcrição, ou pelo tempo o efeito da estimulação da luz deve ser avaliado.

2. Ativação de bioluminescência de proteínas fotossensoriais in vivo

1. Constrói
   1. Selecione uma sequência de luciferase ou uma sequência de fusão de proteínas fluorescentes de luciferase que resultará na expressão de um emissor de luz produzindo luz de um comprimento de onda que corresponde ao fotoreceptor a ser ativado.
   2. Use técnicas padrão de biologia molecular para clonar o DNA em um plasmídeo pAAV, se ainda não estiver disponível de outros investigadores ou depósitos plasmídeos.
   3. Escolha promotores fortes para a expressão dos módulos emissores de luz, como CAG ou CMV.
   4. Use abordagens padrão para preparar estoques virais de alta ^titer6 ou ter vetores virais preparados comercialmente.
   5. Para estudos iniciais, utilize vetores virais separados para a co-transdução do emissor de luz e do sensor de luz para permitir o ajuste das proporções dos diferentes componentes, se necessário.
2. Transdução AAV
   1. Injete o órgão alvo do animal experimental com vetores virais do emissor de luz, sensor de luz e repórter análogo às razões de concentração utilizadas para as transfecções in vitro (Tabela 3).
   2. Devolva os animais para suas gaiolas por pelo menos 2 semanas para permitir a expressão máxima de todos os componentes.
      NOTA: Se o órgão alvo estiver dentro do corpo e protegido da luz ambiente, os animais podem ser alojados em condições normais de luz.
3. Ativação de bioluminescência in vivo
   1. Prepare o substrato de luciferase (luciferina).
      1. Retire um frasco de CTZ solúvel em água do congelador -80 °C e deixe aquecido até a temperatura ambiente. Mantenha-o protegido da luz.
      2. Por frasco de 500 μg, adicione 250 μL de água estéril, usando uma seringa ou abrindo o frasco e adicionando água com uma pipeta, em seguida, colocando a rolha de borracha de volta no frasco de vidro.
      3. Incubar o frasco de vidro reconstituído em um banho de água de 55 °C por alguns minutos para dissolver completamente o pó.
      4. Transfira a solução para um tubo de microcentrifuuagem preto. Enxágüe as paredes do frasco de vidro para recuperar toda a CTZ.
      5. Remova a quantidade de solução necessária para o dia. Armazene a solução restante a 4 °C para uso no dia seguinte. Não congele!
      6. Realizar as mesmas etapas (2.3.1.1.-2.3.1.5) para um frasco de veículo.
   2. Estimulação da luz da bioluminescência
      1. Remova o volume de luciferina/veículo necessário para o tamanho da rota animal e de aplicação escolhida (Tabela 4).
      2. Injete os animais com luciferina ou veículo. Repita a estimulação da luz da bioluminescência de acordo com o desenho experimental. Por exemplo, se a ativação de uma recombinase for desejada durante um paradigma comportamental específico, injete os animais pouco antes do teste comportamental. Se a transcrição afásica de uma molécula é o objetivo, injete os animais repetidamente ao longo dos dias.
      3. Coletar dados dos animais estimulados pela bioluminescência conforme projetado.

Resultados

Existem inúmeros eventos intracelulares que podem ser manipulados com atuadores respondendo à luz, e que são favoráveis à ativação de bimodais com fontes de luz físicas e biológicas. Abaixo estão exemplos que empregam um integrador de cálcio fotoensiva (^Ca2+), translocação de proteína induzida pela luz, um fator de transcrição de detecção de luz e uma recombinase fotossensitiva. Os exemplos ilustram a viabilidade do uso da bioluminescência para ativar vários tipos de fotorreceptores. Os experimentos apresentados não foram especificamente otimizados no que diz respeito à aplicação de diodo emissor de luz (LED), à luciferase escolhida ou com relação às concentrações e tempo de aplicação da luciferina.

A expressão rápida regulada por luz e atividade (FLARE) é um sistema optogenético que permite a transcrição de um gene repórter com a co-incidência de ^ca2+ intracelular aumentado e ^light23 (Figura 4A). A presença do ^Ca2+ é necessária para trazer a protease nas proximidades do local de decote protease acessível apenas com estimulação de luz, resultando na liberação do fator de transcrição. As células HEK293 foram co-transfeinadas com os componentes FLARE originais, uma construção de repórter firefly duplo (FLuc)-dTomato, e uma variante de luciferase gaussia ancorada em membrana sbGLuc6. Na presença de ^ca2+ intracelular aumentado através da exposição de células a 2 μM de ionomicina e cloreto de cálcio de 5 mM (_CaCl2), a aplicação de LED azul levou à expressão robusta do repórter de fluorescência em comparação com as células deixadas no escuro, bem como à expressão de FLuc determinada pela medição da luminescência ao adicionar o substrato FLuc, D-luciferina. Níveis semelhantes de expressão FLuc foram alcançados com bioluminescência emitida pelo sbGLuc após a aplicação do substrato sbGLuc (CTZ) juntamente com ionomicina e _CaCl2. Note que as luciferases utilizadas para ativação de luz (sbGLuc) e para relatar o efeito da ativação da luz (transcrição de FLuc) só produzem luz com suas respectivas luciferinas (CTZ vs. D-luciferina) e não reagem cruzadamente.

Diferentes componentes foram combinados para gerar um sistema de transcrição induzido pela luz com base na heterodimerização dos criptocromatos23,24 (Figura 4B). Cry2 foi fundido a uma protease enquanto o CIB ligado à membrana foi fundido ao local de decote protease e ao fator de transcrição. A translocação de proteína induzida pela luz liberou o fator de transcrição, levando à expressão de FLuc e dTomato, como mostrado na Figura 4A. Enquanto a presença do componente do fator de transcrição por si só resultou em um considerável sinal de fundo possivelmente devido à proteólise espontânea, tanto a luz física (LED) quanto a bioluminescência (CTZ) aumentaram robustamente a expressão do FLuc medida em um sistema de imagem in vivo (IVIS).

Em outro conjunto de experimentos, nanoluc (luciferina: furimazine ou hCTZ) foi empregado para a regulação optogenética da transcrição através da dimerização do CRY/CIB e do fator de transcrição fotossensível, EL22225,26,27. Figura 5A,B mostram os esquemas dos diferentes componentes nos estados escuros e claros e a luciferase co-transfilvada ou fundida ao sensor de luz. Várias comparações são mostradas na Figura 5C. A bioluminescência, induzida pela adição de hCTZ às células HEK293 expressando os construtos e removendo-os após 15 minutos, foi mais eficiente na transcrição do repórter de condução do que 20 minutos de exposição à luz LED tanto para CRY/CIB quanto para EL222. Para o CRY/CIB, uma hora de exposição ao LED foi suficiente para atingir um nível de transcrição comparável a 15 min de bioluminescência. Em contraste, para el222, mesmo 60 min de LED eram apenas metade tão eficaz quanto uma breve exposição à bioluminescência. Não houve diferenças significativas na eficácia da transcrição entre os dois sistemas quando co-transfeinados, embora as proteínas de fusão do CRY/CIB fossem mais eficientes do que as de EL222. Para ambos os sistemas, as proteínas de fusão levaram a níveis de transcrição significativamente mais elevados do que os componentes co-transfectados. O CRY/CIB mostrou níveis de fundo consistentemente mais elevados com a aplicação do veículo em comparação com o EL222, que tinha transcrição de fundo insignificante. O aumento das concentrações de hCTZ por si só não teve efeito na transcrição do gene repórter.

As recombinases fotoativas fornecem uma ferramenta versátil para manipulações optogenomicas. Testamos a ativação da bioluminescência de uma recombinase de cre dividida fotosensível baseada na proteína Vivid LOV, ^iCreV28. A Figura 6A mostra um esquema dos diferentes componentes, sbGLuc, iCreV e um repórter de fluorescência lox-stop-lox (tdTomato) antes e depois da aplicação do CTZ. Os resultados da aplicação CTZ relativa aos controles (sem CTZ ou LED) são mostrados na Figura 6B. Há alguma expressão de fundo mesmo no escuro (sem CTZ); no entanto, na presença de CTZ, a expressão é robustamente aumentada em segundo plano e semelhante à induzida com aplicação LED.

Figura 1: Incubadora selada à luz. Retalho de caixa de papelão cobrindo a luz do painel de controle iluminado (seta superior). Tampa impermeável à luz sobre a porta de vidro da incubadora (seta inferior) para proteger as células da exposição à luz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Capô de fluxo laminar iluminado pela luz vermelha. Configuração mostrando um capô padrão de cultura de tecido de fluxo laminar sendo iluminado pela luz vermelha. A seta indica uma lâmpada de desktop padrão com uma lâmpada vermelha. Todas as manipulações sob a luz vermelha são realizadas em uma sala de outra forma escura e clara. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Compartimentos leves ao redor de microscópios de imagem de células vivas. Dois exemplos de configurações de microscópio de imagem de células vivas mostrando o uso de uma caixa sólida com cortinas de plástico apenas na parte frontal (painéis esquerdos: superior e inferior) ou cortinas pretas ao redor da configuração de imagem (painéis direito: superior e inferior). As laterais dianteiras em ambos os exemplos permanecem abertas e enroladas quando não estão em uso (painéis superiores: esquerda e direita). As cortinas pretas dianteiras são enroladas para evitar que qualquer luz na sala (por exemplo, telas de computador) entre na área de imagem ao realizar estimulação de bioluminescência de células vivas e/ou imagem (painéis inferiores: esquerdo e direito). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Bioluminescência para integração de eventos de sinalização intracelular. (A) Esquemas dos componentes FLARE co-transfeinados com sbGLuc. Na presença do ^Ca2+ e na consequente proximidade da protease ao local do decote protease, seja bioluminescência ou LED levará ao desdobramento do LOV, exposição do local do decote e liberação do fator de transcrição. As células foram expostas ao LED (ciclo de serviço 33%, 2 s on/4 s off por 40 min; 3,5 mW de potência leve, irradiação de 4,72 mW/^cm2 ) ou à bioluminescência (concentração final de CTZ de 100 μM por 15 min) ou deixada no escuro. Imagens microscópicas de células HEK293 expressando os componentes acima após o tratamento para aumentar os níveis de ^Ca2+ e exposição ao LED (esquerda). Luminescência FLuc medida em um luminômetro comparando exposição a LED, bioluminescência (CTZ) ou esquerda no escuro (direita). (B) Esquemas de um sistema de transcrição ^não-Ca2+dependente co-transinfetado com sbGLuc. As células HEK293 em placas de 4 poços foram transfeinadas com quatro arranjos diferentes de componentes, como descrito no esquema. As placas foram expostas a LED (ciclo de serviço 33%, 2 s on/4 s off por 40 min; 3,5 mW de potência leve, irradiação de 4,72 mW/^cm2 ) ou bioluminescência (concentração final de CTZ de 100 μM) adicionando CTZ e deixando-a acesa por 15 min; placas de controle foram deixados no escuro. A transcrição do repórter da FLuc foi medida em um IVIS. Imagens IVIS de pratos representativos são mostradas à esquerda; medições de brilho de várias réplicas baseadas nos controles escuros são mostradas à direita. Barra de escala = 100 μm. Abreviaturas: FLARE = Expressão rápida regulada pela luz e atividade; LOV = detecção de luz-oxigênio-tensão; LED = diodo emissor de luz; CTZ = coelenterazina; FLuc = luciferase de vagalume; dTom = dTomato; CRY2 = criptocromo 2; CRY2PHR = região de folologia fotolyase CRY2; CIB1 = ^Ca2+- e proteína de ligação de integrin 1; CIBN = N-terminus de CIB1; IVIS = sistema de imagem in vivo . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Bioluminescência para transcrição de condução. (A) Esquemas de dois sistemas de transcrição fotoativatáveis em seus estados escuros e claros. (B) NanoLuc foi co-transfectado ou fundido às moieties de detecção de luz como retratado (N-NanoLuc-CRY-GalDD-C; N-NanoLuc-VP16-EL222-C). (C) Comparações utilizando ambos os sistemas em relação a fontes de luz, projeto de construção e sinal ao ruído. As células foram expostas ao LED (ciclo de serviço 33%, 2 s on/4 s off por 40 min; 3,5 mW de potência luminosa, irradiação de 4,72 mW/^cm2 ) ou à bioluminescência por 15 min (concentração final de 100 μM hCTZ; exceto quando diferentes concentrações são observadas). Escuras, as placas foram deixadas intocadas na incubadora entre a transformação inicial de plasmídeos e a medição do FLuc; VEH, as placas eram manuseadas da mesma forma que as que recebiam hCTZ, mas recebiam o veículo. Diferenças nos níveis de transcrição: hCTZ, CRY co-transfectado vs. EL222 - não significativas; hCTZ, luciferase - fusão de fotoproteína CRY vs. EL222 - p < 0,005; hCTZ, CO-transfecção CRY vs. fusão - p < 0,005; hCTZ, co-transfecção EL222 vs. fusão - p < 0,01; veículo, CRY vs. EL222 - p < 0,05. Abreviaturas: UAS = sequência de ativação a montante; LED = diodo emissor de luz; CTZ = coelenterazina; FLuc = luciferase de vagalume; CRY = criptocromo; CIB = ^Ca2+- e proteína de ligação de integrin; VEH = veículo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Bioluminescência para manipulação optogenomic. (A) Esquemas de manipulação optogenomic orientada à bioluminescência usando sbGLuc, os componentes de iCreV divididos e um repórter LSL, antes e depois da aplicação da luz. (B) As células HEK293 foram lipofectadas com plasmídeos, depois mantidas no escuro. Vinte e quatro horas depois, as células foram tratadas por 30 minutos com apenas médio (sem CTZ) ou com CTZ (concentração final de 100 μM) ou com LED (ciclo de serviço 25%, 5 s on/15 s off por 5 min; 14,81 mW de energia leve, irradiação de 20 mW/^cm2 ) como controle positivo. Imagens microscópicas da fluorescência tdTomato usando condições conforme indicado. Barra de escala = 100 μm. Abreviaturas: LSL = lox-stop-lox; CTZ = coelenterazina; LED = diodo emissor de luz; VVD = Vívido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Ativação bioluminescência de fotorreceptores. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Diretrizes para emplacamento e transfeminação de células em diferentes formatos. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 3: Proporções de vários plasmídeos para transfecção. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 4: Rotas de injeção, volumes e concentrações de luciferina para aplicações in vivo (mouse de 25 g). Clique aqui para baixar esta Tabela.

Discussão

Há uma gama de luciferases e luciferinas com comprimentos de onda de emissão de luz que correspondem aos espectros de ativação de proteínas fotosensory de azul a luz ^{vermelha14,29}. Além de alinhar comprimentos de onda de emissão e excitação, não há uma maneira confiável de determinar a priori qual emparelhamento funcionará melhor. Assim, a necessidade de determinar experimentalmente como os pares luciferina-luciferase funcionam em células e organismos na condução de sistemas fotosensórios.

Os protocolos descritos nesta apresentação descrevem como preparar a luciferina e como aplicá-la in vitro e in vivo, juntamente com orientações sobre a instalação de salas, capas de cultura tecidual, incubadoras e microscópios para experimentos que utilizam a bioluminescência. Nos experimentos representativos, foram utilizadas diferentes luciferases (NanoLuc, Gaussia luciferase) com diversas proteínas fotosensory (CRY/CIB, EL222, VVD, LOV) demonstrando os efeitos da bioluminescência versus luz física, co-transfecção versus proteínas de fusão, comparações sinal-ruído e diferentes ensaios de leitura. Mais aplicações de bioluminescência ativando proteínas fotosensory são descritas em publicações de vários grupos, visando a indução de morte celular, síntese de cAMP e movimento proteico, além de transcrição (Tabela 1).

Simplesmente co-transfecionar componentes emissores de luz e detecção de luz é um bom começo. As variáveis são as relações molares do emissor e do sensor; desconhecidos são níveis de fundo de atividade do sensor no escuro, atividade do sensor em relação à intensidade e duração da luz, e a eficiência da ativação do sensor comparando a luz física e biológica. Enquanto os construtos de fusão têm a vantagem de manter a relação molar de emissor e sensor em 1:1 e trazer o emissor de luz perto do domínio de sensor de luz, outras considerações entram em jogo, como onde amarrar (N ou C-terminus) e como ligar (comprimento e composição do linker) sem impactar o desempenho do atuador fotosensório.

Para experimentos in vitro e in vivo, existem múltiplas opções para afinar a emissão de luz bioluminescente, seja variando a concentração da luciferina, e/ou variando o tempo em que a luciferina é disponibilizada para o respectivo sensor. O valor e o tempo mínimos são determinados pela presença ou ausência do efeito esperado com a ativação da luz. Em contraste, as respectivas máximas são determinadas principalmente pela tolerância das células às altas concentrações de luciferina em tempos prolongados. A concentração de CTZ escolhida nos exemplos acima, de 100 μM, é próxima do limite superior para vários tipos de células, de células HEK293 a neurônios. O objetivo é usar o menor nível possível de concentração para conseguir a ativação do domínio de fotosensão direcionado. Isso será conseguido mais facilmente usando luciferases com alta emissão de luz e fotorreceptores com alta sensibilidade à luz.

A bioluminescência para fotorreceptores de condução tem sido usada em roedores (ratos, ratos) com proteínas de fotosensão expressas no fígado, músculo, medula espinhal e cérebro, bem como através de células expressas por fotoreceptores transplantadas subcutânea ou intraperitonel. Em princípio, não há limites que impeçam que a abordagem seja aplicada a diferentes espécies, desde primatas não humanos até peixes ou moscas. Dependendo da permeabilidade do organismo para a luciferina, a aplicação pode ser tão fácil quanto aplicar a luciferina na água circundante (por exemplo, em larvas ^{de peixe30}). Antes de usar o BL-OG em qualquer novo organismo, os experimentos piloto devem ser realizados para garantir que a luciferina atinja seus alvos através da rota de aplicação escolhida.

Aspectos críticos do desenho experimental são os diversos controles que são importantes para a interpretação dos resultados. As células que expressam um repórter impulsionado por uma luciferase agindo em uma proteína fotossensorial devem ser comparadas com células que não têm a luciferase ou não têm a proteína fotossensorial. Além disso, devem ser feitas comparações entre células expostas à luciferina, veículo ou mantidas no escuro. Também é importante perceber as limitações de diferentes ensaios para avaliar os efeitos da ativação do fotorreceptor orientado pela bioluminescência. Por exemplo, a eficácia da transcrição ativada pela bioluminescência pode ser testada de diferentes maneiras, dependendo se o gene repórter é uma luciferase ortogonal (luminômetro, IVIS), ou uma proteína fluorescente (classificação celular ativada por fluorescência, análise de imagem de microscopia). Embora os efeitos básicos devam ser reprodutíveis entre as plataformas de teste, os aspectos quantitativos dos efeitos podem variar consideravelmente.

A ativação da bioluminescência de fotorreceptores tem sido demonstrada até agora para um número limitado de luciferases e proteínas fotosensory, respectivamente, tanto in vitro quanto in vivo. Pode ser estendido à grande classe de fotorreceptores para ativar muitos outros processos biológicos. Tal expansão da abordagem é ainda mais promovida pelo desenvolvimento contínuo de novos pares de proteínas luciferase-fluorescência com emissão de luz muito maior do que as luciferases de ocorrência natural e com características cinéticas incapazes de diferentes aplicações. Esses avanços são paralelos pela geração de novas luciferinas, aumentando ainda mais o brilho e as paletas de ^cores29. Esta plataforma de ferramentas oferece aplicativos para manipular e investigar dinâmicas intracelulares e interações celulares dentro de células vivas, tecidos e organismos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABI 25W Deep Red 660 nm LED Light Bulb	Amazon		to be used with any lamp stand
Black Microcentrifuge Tubes, 0.5 mL, Argos Technologies	Fisher Scientific	03-391-166
Black Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL, Argos Technologies	Fisher Scientific	03-391-161
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric (1.5 m x 2.7 m) x 0.12 mm (thick)	THOR LABS	BK-5
C120-Fluc			K. Gardner
CaCl2	Sigma	C8106; CAS: 10035-04-8
Ca-FLARE protease, transcription factor and reporter		Addgene # 92214, 92213, 92202	A. Ting
CIB-VP64 (B1016)		Addgene # 92037	C. Tucker
CRY-GalΔDD (B1013)		Addgene # 92035	C. Tucker
CTZ	Prolume Inc. (NanoLight)	303	formulation for in vitro applications with Gaussia luciferases
CTZ (Water soluble native coelenterazine)	Prolume Inc. (NanoLight)	3031	formulation for in vivo applications with Gaussia luciferases
D-(+)-Glucose	Sigma	G8270; CAS: 50-99-7
D-Luciferin, Potassium Salt	Gold Biotechnology	LUCK
DMEM	Thermo Fisher	11960044
D-PBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher	14190144
hCTZ	Prolume Inc. (NanoLight)	301	formulation for in vitro applications with Oplophorus luciferases
HEK293	ATCC	CRL-1573
HeLa	ATCC	CCL-2
HEPES	Sigma	H3375; CAS: 7365-45-9
iCreV			A. Cetin and H. Zeng
In Vivo Imaging System (IVIS)	Perkin-Elmer	Lumina LT
KCl	Sigma	P5405; CAS: 7447-40-7
LED Array Driver	Amuza	LAD-1
LED Array for Multiwell Plates	Amuza	LEDA-x
Lipofectamine 2000 Reagent	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent
Luminometer	Molecular Devices	SpectraMax L
MgCl2 Hexahydrate	Sigma	M2670; CAS: 7791-18-6
NaCl	Sigma	S7653; CAS: 7647-14-5
NanoFuel Solvent	Prolume Inc. (NanoLight)	399	for dissolving CTZ preparations for in vitro use
NaOH	Sigma	221465; CAS: 1310-73-2
NES-CRY2PHR-TevC		Addgene # 89877	H. Kwon
Opti-MEM	Thermo Fisher	11058021	transfection medium
PDL coated coverslips (12 mm, 15 mm, 18 mm)	Neuvitro Corporation	GG-12-PDL, GG-15-PDL , GG-18-PDL
pGL2-GAL4-UAS-Luc		Addgene #33020	M. Walsh
Prizmatix USB Pulser TTL Generator for Optogenetics	Goldstone Scientific
TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16		Addgene # 89878	H. Kwon
TrypLE Express	Gibco	12604-013
Vehicle (Water-soluble carrier without CTZ)	Prolume Inc. (NanoLight)	3031C	control for in vivo applications with CTZ
VP-EL222			K. Gardner