Transformação e regeneração de raízes pilosas em Arabidopsis thaliana e Brassica napus

Resumo

O protocolo descreve indução de raízes pilosas utilizando hastes primárias de inflorescência de Arabidopsis e hipocótilos de Brassica napus . As raízes pilosas podem ser cultivadas e usadas como explantes para regenerar plantas transgênicas.

Resumo

A transformação de raízes peludas representa uma ferramenta versátil para a biotecnologia vegetal em várias espécies. A infecção por uma cepa de Agrobacterium portadora de um plasmídeo indutor de raízes (Ri) induz a formação de raízes pilosas no local da lesão após a transferência de T-DNA do plasmídeo Ri para o genoma da planta. O protocolo descreve em detalhes o procedimento de indução da raiz pilosa à base de injeção em Brassica napus DH12075 e Arabidopsis thaliana Col-0. As raízes pilosas podem ser utilizadas para analisar um transgene de interesse ou processadas para a geração de plantas transgênicas. Meio de regeneração contendo citocinina 6-benzilaminopurina (5 mg/L) e ácido auxina 1-naftalenoacético (8 mg/L) provoca com sucesso a formação de brotos em ambas as espécies. O protocolo abrange a genotipagem e seleção de plantas regenerantes e T1 para obtenção de plantas portadoras de um transgene de interesse e livres de T-DNA do plasmídeo Ri. Um processo alternativo que leva à formação de uma planta composta também é descrito. Neste caso, as raízes pilosas são mantidas na parte aérea (em vez das raízes naturais), o que permite o estudo de um transgene em culturas de raízes pilosas no contexto de toda a planta.

Introdução

A transformação vegetal é o gargalo de qualquer estudo genético em biologia vegetal. Uma bactéria transmitida pelo solo, Agrobacterium tumefaciens, é amplamente utilizada como um meio de entrega de genes por imersão floral ou cultura de tecidos para gerar transformantes. A. tumefaciens infecta plantas em um local de ferimento e causa tumores devido à transferência e integração de T-DNA de um plasmídeo indutor de tumor (Ti) no genoma da planta hospedeira. Cepas de A. tumefaciens projetadas com plasmídeo de Ti modificado sem o T-DNA selvagem e um vetor binário com T-DNA artificial e sítios de clonagem para inserção de um gene de interesse são comumente usadas como um eficiente sistema de transformação vegetal¹. No entanto, muitas espécies-modelo e culturas são recalcitrantes ao mergulho floral ou à regeneração in vitro de plantas ou apresentam longos ciclos de crescimento, impactando a eficiência desse sistema de transformação.

Agrobacterium rhizogenes induz a formação de raízes adventícias, ou raízes pilosas, no local da lesão após infectar uma planta hospedeira. Semelhante a A. tumefaciens, A. rhizogenes transfere um T-DNA de um plasmídeo indutor de raízes (Ri) para o genoma da planta hospedeira, causando o desenvolvimento de raízes pilosas transgênicas. Esse processo é controlado principalmente pelos genes dos loci oncogênicos radiculares (rol)^2,3. Usando linhagens de agrobactérias carregando tanto o plasmídeo Ri quanto um vetor binário artificial que codifica um gene de interesse, culturas de raízes pilosas têm sido usadas para produzir proteínas recombinantes, analisar a função de promotores ou genes, ou editar genomas usando Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)^4,5,6.

Nosso protocolo utiliza a cepa transconjugante Ti-less A. tumefaciens C58C1 portadora do plasmídeo Ri pRiA4b⁷. O T-DNA do plasmídeo Ri consiste de duas regiões, DNA-T direito e esquerdo (DNA-TR e DNA-TL, respectivamente), que podem se integrar independentemente ao genoma vegetal8^. Explorando esse sistema, otimizou-se o longo processo de transformação de explantes em cultivares de DH12075 Brassica napus ⁹. O protocolo detalhado abaixo permite a regeneração de linhagens pilosas selecionadas e a obtenção de plantas T1 portadoras do transgene de interesse e livres de genes rol em aproximadamente 1 ano. A transformação de raiz pilosa à base de injeção pode ser usada em outras espécies de Brassicaceae, como mostrado pela transformação de Arabidopsis thaliana Col-0. Enquanto o hipocótilo é usado para transformar B. napus, A. thaliana é injetado no caule primário da inflorescência.

Protocolo

1. Preparação de mídias e soluções

1. Prepare as soluções de estoque de hormônios.
   1. Para a preparação de 50 mL de solução estoque de ácido 1-naftalenoacético (ANA), 6-benzilaminopurina (BAP) e ácido indol-3-butírico (AIB) com concentração de 5 mg/mL, dissolver 250 mg do hormônio em pó em 2 mL de hidróxido de sódio (NaOH) 1 M e ajustar o volume para 50 mL com água ultrapura.
   2. Para preparar 50 mL de ácido giberélico (GA₃) com uma concentração de 1 mg/mL, dissolver 50 mg do hormônio em pó em 2 mL de etanol e ajustar o volume para 50 mL de água ultrapura.
   3. Filtrar a solução utilizando um filtro de seringa estéril com poros de 0,22 μm e distribuí-la em tubos estéreis de 2 ml para armazenamento. Conservar a solução a -20 °C ou 4 °C, dependendo da recomendação do fabricante.
2. Preparar soluções estoque de antibióticos. Para 50 mL de cefotaxima e solução estoque dissódica de ticarcilina com concentração de 100 mg/mL, dissolver 0,5 g do antibiótico em pó em 40 mL de água ultrapura e ajustar para um volume final de 50 mL. Filtrar a solução utilizando um filtro de seringa estéril com poros de 0,22 μm e distribuí-la em tubos estéreis de 2 ml para armazenamento. Conservar a solução a -20 °C.
   NOTA: Antibióticos e hormônios são sempre adicionados ao meio resfriado.
3. Preparar 1 L de meio Luria Broth (LB) adicionando 10 g de bacto-triptona, 5 g de extracto de levedura e 5 g de cloreto de sódio (NaCl) num cilindro de medição de 1 L e ajustar o volume para 1 L com água bidestilada. Ajuste o pH para 7,0 com KOH com um medidor de pH (seguindo as instruções do fabricante). Transferir a solução para um frasco de 1 L e adicionar 15 g de ágar bacteriológico (1,5%), se for preparado um meio sólido e autoclavar o meio. Se necessário, adicione os antibióticos apropriados (a resistência bacteriana é transportada no vetor binário) ao meio resfriado.
   NOTA: Use uma autoclave para esterilizar a solução. Coloque o frasco no cesto, feche a tampa e esterilize-o por 20 min a 121 °C e 98,9 kPa. Este protocolo é sempre utilizado para soluções de autoclavagem em etapas posteriores.
4. Preparar 1 L de extrato de levedura em meio bovino (YEB) misturando 5 g de extrato bovino, 1 g de extrato de levedura, 5 g de peptona, 5 g de sacarose e 0,5 g de cloreto de magnésio (MgCl₂) em água bidestilada. Ajuste o volume para 1 L. Transfira a solução para um frasco de 1 L. Autoclave o meio.
5. Preparar 1 L de meio para germinação das sementes misturando 2,2 g de pó de Murashige e Skoog (MS), 10 g de sacarose (1%) e 0,5 g de sais de sódio do ácido 2-(N-Morpholino)etanossulfônico (MES) em água bidestilada. Ajuste o volume para 1 L, misture e ajuste o pH para 5,8 com KOH. Transferir a solução para um frasco de 1 L e adicionar 8 g de ágar vegetal (0,8%). Autoclave o meio.
6. Preparar 1 L de meio de cultura misturando 2,2 g de pó de MS, 5 g de sacarose (0,5%) e 0,5 g de sais de MES em água bidestilada. Ajuste o volume para 1 L, misture e ajuste o pH para 5,8 com KOH. Transferir a solução para um frasco de 1 L e adicionar 8 g de ágar vegetal (0,8 %). Autoclave o meio.
7. Preparar 1 L de meio de crescimento de raiz pilosa misturando 4,4 g de MS + B5 vitaminas em pó, 30 g de sacarose (3%) e 0,5 g de sais MES em água bidestilada. Ajuste o volume para 1 L, misture e ajuste o pH para 5,8 com KOH e transfira a solução para um frasco de 1 L. Adicionar 3 g de gelificante (0,3%) e autoclavar o meio. Adicionar cefotaxima e ticarcilina dissódica a uma concentração final de 100 - 200 mg/L e 100 - 500 mg/L, respectivamente. Se necessário, adicione os antibióticos apropriados (a resistência é devida ao T-DNA de um vetor binário).
8. Preparar 1 L de meio de crescimento vegetal composto misturando 2,2 g de MS + B5 vitaminas em pó, 10 g de sacarose (1%) e 0,5 g de sais MES em água bidestilada. Ajuste o volume para 1 L, misture e ajuste o pH para 5,8 com KOH e transfira a solução para um frasco de 1 L. Adicionar 6 g de gelificante (0,6%) e autoclavar o meio. Adicionar cefotaxima e ticarcilina dissódica a uma concentração final de 200 mg/L e 500 mg/L, respectivamente. Se necessário, adicione os antibióticos apropriados (a resistência é devida ao T-DNA de um vetor binário).
9. Preparar 1 L de meio de regeneração misturando 4,4 g de MS + B5 vitaminas em pó, 30 g de sacarose (3%) e 0,5 g de sais MES em água bidestilada. Ajuste o volume para 1 L, misture e ajuste o pH para 5,8 com KOH. Transferir a solução para um frasco de 1 L e adicionar 3 g de gelificante (0,3 %). Autoclave o meio. Adicionar NAA e BAP a uma concentração final de 8 mg/L e 5 mg/L, respectivamente, e ticarcilina dissódica a uma concentração final de 100 mg/L.
10. Preparar 1 L de meio de alongamento da parte aérea misturando 4,4 g de MS + B5 vitaminas em pó, 20 g de sacarose (2%) e 0,5 g de sais MES em água bidestilada. Ajuste o volume para 1 L, misture e ajuste o pH para 5,8 com KOH. Transferir a solução para um frasco de 1 L e adicionar 3 g de ágar vegetal (0,3%). Autoclave o meio. Adicionar BAP e GA₃ a uma concentração final de 0,5 mg/L e 0,03 mg/L, respectivamente, e cefotaxima a uma concentração final de 100 mg/L.
11. Preparar 1 L de meio de indução radicular misturando 2,2 g de MS + B5 vitaminas em pó, 10 g de sacarose (1%) e 0,5 g de sais MES em água bidestilada. Ajuste o volume para 1 L, misture e ajuste o pH para 5,8 com KOH. Transferir a solução para um frasco de 1 L e adicionar 3 g de gelificante (0,3%). Autoclave o meio. Adicionar AIB e cefotaxima a uma concentração final de 0,5 mg/L e 100 mg/L, respectivamente.
12. Preparar 1 L de tampão brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB) adicionando 20 g de CTAB (2% p/v final), 100 ml de Tris-HCl 1M, pH 8,0 (100 mM final), 40 ml de EDTA 0,5 M, pH 8,0 (20 mM final), 81,8 g de NaCl (1,4 M final) e 5 g de PVP40 (0,5% p/v final). Ajuste para 1 L com água destilada dupla. Autoclave a solução. Conservar a solução até 1 ano à temperatura ambiente.

2. Transformação de Agrobacterium com vetor binário

1. Preparar o DNA de um plasmídeo binário verificado contendo o T-DNA para ser integrado ao genoma da planta. Certifique-se de que o DNA plasmidial contenha baixos sais para evitar faíscas elétricas à medida que a eletroporação é usada. Recomenda-se o uso de um kit de extração de DNA plasmidial de escolha.
2. Preparar células eletrocompetentes de Agrobacterium tumefaciens C58C1 contendo o plasmídeo pRiA4b indutor de raízes pilosas inoculando 200 mL de YEB líquido pré-aquecido (28 °C) com 8 mL de uma cultura fresca durante a noite. Incubar a cultura a 28 °C enquanto agita até que a densidade óptica a 600 nm (OD₆₀₀) seja de cerca de 0,5, correspondendo à fase logarítmica média. Leva cerca de 4 - 5 h.
3. Divida a cultura de Agrobacterium em quatro tubos de centrífuga estéreis pré-resfriados de 50 mL. Centrifugar durante 15 min a 4 °C a 3.200 x g.
   NOTA: As células devem ser mantidas frias a partir desta etapa.
4. Retire o sobrenadante e ressuspenda o pellet suavemente em (4x) 2,5 mL de glicerol a 10% frio (4 °C). Adicione mais 47,5 mL de glicerol 10% gelado e misture delicadamente.
5. Células pellet a 3.200 x g por 15 min a 4 °C. Eliminar o sobrenadante e ressuspender as células em (4x) 10 mL de glicerol frio a 10%.
6. Pastilhar novamente as células e ressuspendê-las em (4x) 0,75 mL de glicerol frio a 10%. Agrupar o conteúdo dos quatro tubos em um (volume total = 3 mL).
7. Divida a solução agrobacteriana em alíquotas de 50 μL em microtubos estéreis pré-resfriados de 1,5 mL. Congelar as alíquotas em gelo seco ou nitrogênio líquido. Conservar os tubos a -80 °C para utilização futura.
8. Colocar um tubo de células competentes (50 μL) no gelo, misturar com 5 μL de ADN plasmidial (1 μg no total, a partir do passo 2.1), transferir a mistura para uma cubeta de eletroporação (0,2 cm de intervalo) e incubar durante 5 minutos no gelo.
9. Coloque a cubeta no eletroporator e eletropore as células com as seguintes regulagens: capacitância 25 μFD, resistência 400 Ω, tensão elétrica 2,5 kV, duração do pulso 9,7 ms.
10. Adicionar 950 μL de meio líquido LB às células, que são então cultivadas a 28 °C por 2 h a 300 rpm em um termomisturador. Placa de 50 μL da cultura celular em meio LB sólido com antibiótico seletivo apropriado. Cultivar as placas por 2 dias a 28 °C.
    NOTA: Recomenda-se a placa de uma gama de culturas de células (10 μL - 100 μL) por placa para determinar um volume de cultura adequado e evitar o crescimento excessivo de bactérias.
11. Preparar culturas líquidas de algumas colônias selecionadas em 5 mL de meio líquido LB com antibióticos. Cultivar as bactérias durante a noite a 28 °C com agitação. Use essas culturas para estoques de glicerol misturando 0,5 mL de cultura de bactérias líquidas e 0,5 mL de glicerol a 40%.
    NOTA: Estas colônias são verificadas quanto à presença do transgene por PCR de colônia. Para este propósito, adicione uma pequena quantidade de uma colônia de uma placa à mistura mestre de PCR contendo tampão, dNTP e Taq polimerase de escolha, juntamente com primers amplificando uma parte do T-DNA de um vetor binário. O inóculo dos estoques de glicerol é utilizado para a transformação das plantas.

3. Transformação da raiz peluda de Brassica napus DH12075

1. Coloque as sementes de Brassica napus DH12075 em microtubos e esterilize-as em uma caixa de fluxo. Primeiro, desengraxe as sementes usando água e detergente a 0,1% enquanto agita por 60 s. Em seguida, enxaguar as sementes com água seguida de etanol 70%, ambos por 60 s.
2. Esterilizar as sementes com solução a 10% de água sanitária comercial contendo hipoclorito de sódio. Agite as sementes nesta solução durante 20 minutos.
3. Lave as sementes 4x com água estéril por 60 s cada. Colocá-los em placas de Petri contendo o meio de germinação das sementes. Estratificar as sementes a frio a 4 °C durante a noite e mover as placas para uma sala de cultivo (21 °C, 16 h claro/8 h escuro).
4. Transfira mudas de 5 dias de idade para caixas de cultura de plantas contendo um meio de crescimento vegetal.
   OBS: A melhor eficiência de transformação em DH12075 foi identificada para mudas com 18 dias de idade. A idade das plântulas pode ser otimizada para as condições locais de crescimento ou outras cultivares.
5. Inocular uma cultura líquida de Agrobacterium tumefaciens C58C1 carregando um plasmídeo indutor de raiz pilosa pRiA4b e o vetor binário para transformação (a partir do passo 2.11) com uma alça de inoculação. Use 5 mL de meio LB. Cultivar esta cultura durante a noite a 28 °C até atingir OD₆₀₀ = 0,9 - 1.
   NOTA: Agrobacterium contendo apenas o plasmídeo Ri é usado se raízes pilosas selvagens são produzidas.
6. Injetar uma pequena quantidade de cultura (aproximadamente 50 μL) com uma seringa de insulina no hipocótilo de uma plântula com 18 dias de idade (a partir do passo 3.4.). Puncione o hipocótilo com uma agulha 26G montada na seringa a cerca de 1 cm acima da superfície do meio. Injete o líquido na ferida. O tecido na superfície do hipocótilo também pode ser arranhado pela seringa.
   OBS: O número de mudas inoculadas deve ser adaptado às necessidades do experimentador.
7. Retornar as plantas à sala de cultivo a 21 °C por 2 a 4 semanas até que um calo e raízes pilosas sejam formados no local da ferida.
8. Cortar o calo com as raízes pilosas emergidas do hipocótilo e colocá-lo em uma placa de Petri com o meio de crescimento radicular piloso contendo antibióticos seletivos (transportados pelo T-DNA) e cefotaxima (200 mg/L) e ticarcilina (500 mg/L) para suprimir o crescimento agrobacteriano. Sele as placas de Petri com fita métrica permeável a gás. Cultivar as raízes pilosas a 24 °C no escuro.
   NOTA: A concentração adequada de antibióticos específicos usados para seleção funcional deve ser testada com raízes peludas selvagens. Para B. napus DH12075 raízes pilosas que carregam resistência à canamicina, uma concentração de 25 mg/L de canamicina é usada.
   OBS: Nesta etapa, é possível gerar uma planta composta por parte aérea selvagem e raízes peludas transgênicas que sustentam o crescimento dessa planta. Em vez de cortar as raízes peludas de um caule, as raízes nativas da planta são removidas. A planta com raízes pilosas emergentes é transferida para uma caixa de cultura de plantas com um meio de crescimento composto contendo cefotaxima (200 mg/L) e ticarcilina (500 mg/L) para suprimir o crescimento de agrobactérias, e o antibiótico seletivo (carreado pelo T-DNA).
9. Após 1 a 2 semanas, isole as raízes pilosas da placa de Petri do calo e individualize-as em placas com o mesmo meio de cultura. Transfira a cultura para um prato fresco a cada 4 a 5 semanas. Adicionar 0,25 mg/L de AIB para aumentar a ramificação radicular.
10. Reduzir as concentrações de cefotaxima e ticarcilina gradualmente em cada transferência em 100 mg/L (ou seja, o meio para a primeira transferência contém 100 mg/L de cefotaxima e 400 mg/L de ticarcilina; para a segunda transferência, 300 mg/L de ticarcilina, etc.). Após 3 a 4 meses, cultivar as raízes pilosas em meio de crescimento de raízes pilosas com 100 mg/L de ticarcilina e antibiótico seletivo.

4. Regeneração de Brassica napus DH12075 raízes peludas

1. Transfira linhas de raízes pilosas independentes para placas com meio de regeneração em condições estéreis usando pinças, com chama antes do uso. Transferir 5 - 10 raízes por placa de Petri e cultivá-las a 21 °C em um fotoperíodo de dias longos (16 h claro / 8 h escuro). Sele as placas de Petri com fita métrica permeável a gás.
2. A cada 3 a 4 semanas, transfira as raízes pilosas para placas com meio de regeneração fresco. Note que os calos são formados após aproximadamente 2 semanas. O calo começa a disparar após mais 2 semanas até 8 - 9 semanas após a formação do calo.
3. Individualizar os brotos e transferi-los para caixas de cultura de plantas com meio de alongamento da parte aérea por 2 a 3 semanas para promover o alongamento dos brotos.
4. Transfira os brotos alongados para caixas de cultura de plantas com meio de indução radicular. Atualize a cultura a cada 3 - 4 semanas. A eficiência de enraizamento em DH12075 é de 87% aos 30 dias e de até 100% aos 60 dias.
5. Transfira as plantas enraizadas para o solo após remover quaisquer vestígios de agente gelificante para evitar a infecção fúngica. Certifique-se de que as plantas são primeiro aclimatadas nos fitótrons (21 °C, fotoperíodo de dias longos, 150 μE) e, em seguida, transferi-las para uma estufa para floração (21 °C / 18 °C, fotoperíodo de dias longos, 150 μE).

5. Seleção de plantas regenerativas e T1

NOTA: As linhas de raiz peludas podem ser selecionadas antes de entrar no processo de regeneração. O tipo de seleção depende do conteúdo transportado pelo transgene. As raízes pilosas podem ser amostradas para extração de DNA e genotipagem ou detecção de mutação, extração de RNA com subsequente síntese de cDNA e RT-qPCR para análise do nível de expressão do gene de escolha, microscopia para detecção de fluorescência ou tratadas para coloração de GUS.

1. Após a transferência para o solo, genotipar novamente as plantas regeneradoras T0 (e as plântulas T1) para evitar escapes dos procedimentos de seleção. As plantas T0 exibem um fenótipo alterado denominado fenótipo Ri: crescimento extenso das raízes, folhas crespas e brotações anãs causadas pela presença do TL e/ou TR-DNA do plasmídeo Ri inserido no genoma da planta.
2. Para acelerar a seleção de T1, utilizar as sementes contendo embriões verdes maduros (aprox. 21 - 28 dias após a polinização para DH12075 para um embrião de torpedo ou mais velho) de plantas regenerantes T0 para resgate de embriões.
   1. Trabalhe na caixa de fluxo estéril. Recolher as sílicas e esterilizá-las superficialmente com etanol 70%.
   2. Coloque-os em uma fita dupla face colada em uma tampa de placa ou um slide.
   3. Usando um estereobinóculo, corte a silique ao longo das margens da válvula usando uma agulha 26G. Certifique-se de que o corte não danifique as sementes. Para facilitar a aderência, monte a agulha em uma seringa de 1 mL.
   4. Abra os carpelos e cole-os na fita. Coletar as sementes imaturas e transferi-las para placas com meio para germinação das sementes. Sele as placas com fita adesiva permeável a gás.
   5. Colocar as placas numa sala de cultivo (21 °C, 16 h claro/8 h escuro) até à germinação.
3. Genótipo das plântulas T1 quanto à presença do transgene de interesse e ausência do Ri TR/TL (Figura 1). Coletar material foliar e extrair seu DNA usando o método de escolha. O método CTAB é descrito aqui:
   1. Recolher o material foliar num microtubo de 2 mL contendo duas esferas cerâmicas. Congelar o tubo em nitrogênio líquido.
   2. Triture o material usando um moinho de bolas. Alternativamente, pilão e argamassa podem ser usados.
   3. Depois de uma rotação rápida para baixo, adicione 400 μL de tampão CTAB ao pó. Vórtice brevemente, gire para baixo e incube a 60 °C por pelo menos 50 min.
   4. Arrefecer a solução à temperatura ambiente durante 15 minutos. Adicione um volume de clorofórmio e misture delicadamente.
      CUIDADO: Ao usar clorofórmio, trabalhe sob o fluxo químico e use luvas para proteção. Qualquer solução que contenha clorofórmio deve ser eliminada no contentor de resíduos adequado.
   5. Centrifugar por 5 min a 18.400 x g usando uma centrífuga de mesa. Transferir 250 - 350 μL da fase aquosa superior para um novo microtubo. Omitir a interfase.
   6. Adicione um volume de isopropanol, misture bem e incube por 5 min à temperatura ambiente. Centrifugar por 40 min a 18.400 x g.
   7. Descarte o líquido e adicione 200 μL de etanol 70%. Lave o pellet e a centrífuga por 15 min a 18.400 x g.
   8. Descarte o líquido. Seque o pellet ao ar e adicione 50 - 100 μL de água ultrapura. Deixe o DNA dissolver por 1 h para passar a noite na geladeira.
4. Realizar uma genotipagem por PCR para o gene rolA (TL), o gene aux1 (TR) e o locus virC (Agrobacterium). Preparar a reação de PCR usando o DNA preparado (da etapa 5.3.), primers, tampão, dNTP e Taq polimerase de acordo com o protocolo do fabricante. Os fragmentos amplificados têm de 200 a 500 pb de comprimento.
   Primers específicos para rolA:
   Avante: GTTAGGCGTGCAAAGGCCAAG
   Reverso: TGCGTATTAATCCCGTAGGTC
   Primers específicos para aux1:
   Avante: CATAGGATCGCCTCACAGGT
   Reverso: CGTTGCTTGATGTCAGGAGA
   Primers específicos para virC:
   Avante: AATGCGTCTCTCTCGTGCAT
   Reverso: AAACCGACCACTAACGCGAT
   NOTA: A transferência e integração do DNA-T podem ser parciais, e apenas partes de TL e/ou TR podem se integrar ao genoma. Assim, recomenda-se analisar a presença de outras ORFs de CT (e.g., rolB e rolC) e TR (aux2, mas1, ags1) em plântulas T1. Sequências de primers específicas para esses loci estão listadas em Jedličková et ^al.9.
5. Avaliar reações de PCR por eletroforese em gel.
   NOTA: Recomenda-se incluir um controle positivo nesta análise para garantir ter DNA de grau PCR.
6. Selecionar para a presença (ou ausência) do transgene de acordo com os protocolos baseados no conteúdo deste transgene.
7. Transfira mudas selecionadas para o solo.

6. Transformação e regeneração de raízes pilosas em Arabidopsis thaliana Col-0

1. Esterilizar superficialmente sementes de A. thaliana com um método de escolha (água sanitária, etanol ou gás cloro).
2. Sementes estéreis em placa em meio para germinação das sementes. Após 2 dias de estratificação fria, mover as placas para uma sala de cultivo (21 °C com fotoperíodo de dias longos e 50% de umidade).
3. Transfira as mudas com 1 semana de idade para uma caixa de cultura de plantas com meio de crescimento vegetal.
4. Preparar culturas de Agrobacterium conforme indicado na etapa 3.5.
5. Injetar uma pequena quantidade de cultura (aproximadamente 50 μL) com uma agulha montada em uma seringa de insulina na base do caule primário da inflorescência (aproximadamente 1 - 2 cm acima da roseta) de plântulas de Arabidopsis com 1 mês de idade. O tecido na superfície da haste primária também pode ser riscado pela seringa.
6. Em 2-4 semanas após a injeção, excisar as raízes pilosas emergentes e cultivá-las em placas de Petri com o meio de crescimento da raiz pilosa suplementado com o antibiótico seletivo (transportado pelo T-DNA) e cefotaxima (200 mg/L) e ticarcilina (500 mg/L) para suprimir o crescimento agrobacteriano. Incubar as placas a 24 °C no escuro.
7. Após 1 a 2 semanas, individualizar as raízes pilosas em placas com o mesmo meio de cultura. Transfira as linhas de raiz peludas selecionadas para um meio fresco a cada 4 - 5 semanas.
   NOTA: As raízes pilosas de A. thaliana são mais finas que as de B. napus, e deve-se ter cautela ao transferir para meios frescos.
8. Transfira as raízes pilosas para placas com meio de regeneração para induzir a formação de calos. Cultivar as placas a 21 °C em fotoperíodo de dias longos (16 h claro / 8 h escuro).
9. Os brotos emergem do calo após 18 - 21 dias de cultivo. Corte os brotos e transfira-os para um meio de alongamento dos brotos por 2 a 3 semanas para promover o crescimento e alongamento.
10. Transfira os brotos alongados para o meio de indução radicular.
11. Transfira as plantas enraizadas para o solo. As plantas T0 também apresentam fenótipo de Ri. Realizar a seleção transgênica, conforme descrito para B. napus DH12075 (etapa 5).

Discussão

Desenvolvemos um protocolo simples para transformação de raízes pilosas e posterior regeneração em B. napus e A. thaliana. Esse processo inclui a indução de raízes pilosas à base de injeção no caule do hipocótilo (B. napus) ou da inflorescência primária (A. thaliana). O método de injeção do hipocótilo com a linhagem C58C1 da agrobactéria portadora de um plasmídeo Ri também foi eficaz na família Fabaceae10,11, além dos membros de Brassicaceae apresentados neste estudo.

Uma alternativa ao método baseado em injeção é a transformação baseada em imersão que consiste na imersão do explante em uma suspensão bacteriana, seguida do co-cultivo do explante com agrobactérias. A vantagem do método injetável sobre o método de imersão é a economia de tempo pela ausência de algumas etapas do protocolo: preparo do explante, teste do tempo de co-cultivo e cultivo em meio contendo hormônio para indução de raízes pilosas. Embora ambas as abordagens sejam eficazes para a indução de raízes pilosas, maior eficiência de transformação foi observada em algumas espécies com o método baseado em injeção em comparação com o método de imersão em explante^12,13. Além disso, a transformação baseada em injeção também é útil para gerar plantas compostas (raízes pilosas transgênicas e brotos selvagens). Depois de cortar as raízes originais da planta transformada, as raízes pilosas suportam o crescimento da planta, e o transgene pode ser estudado no contexto de toda a planta.

A etapa crítica da indução da raiz pilosa é a injeção do inóculo no hipocótilo, ou caule primário da inflorescência. Os hipocótilos de B. napus são quebráveis, e o corte de todo o hipocótilo pode facilmente acontecer. O mesmo pode ser observado com A. thaliana devido à finura do caule da inflorescência. Se for necessária uma comparação da eficiência de transformação de diferentes espécies/cultivares, recomendamos que uma pessoa realize todos os experimentos para evitar o erro causado pela manipulação e habilidade em injetar as plantas.

Desenvolvemos um protocolo eficaz para regeneração radicular pilosa em B. napus DH12075 e A. thaliana Col-0. Como a regeneração é um processo altamente variável, algumas modificações de protocolo podem ser aplicadas a uma espécie ou cultivar de escolha. Por exemplo, os brotos derivados de raízes pilosas podem ser eliciados por uma relação auxina/citocinina diferente (1:1) em B. oleracea¹⁴. Alternativamente, pode-se utilizar citocinina thidiazuron em substituição à BAP, como no caso das raízes pilosas de B. campestris ¹⁵.

Múltiplas inserções do T-DNA plasmidial de Ri no genoma da planta representam uma limitação potencial do sistema de transformação e regeneração de raízes pilosas. Nesses casos, nenhuma planta isenta de LT/TR do plasmídeo Ri é descoberta após análise de segregação de plântulas T1. Assim, recomendamos gerar várias linhas radiculares pilosas independentes para cada transgene.

As culturas de raízes pilosas são uma ferramenta extremamente poderosa para estudos funcionais de genes, principalmente devido ao seu rápido estabelecimento e manutenção barata (sem necessidade de hormônios nos meios de cultivo). Este protocolo abrange os métodos de indução e regeneração de raízes pilosas em B. napus e A. thaliana, que podem ser utilizados para estudar o transgene de interesse diretamente em culturas de raízes pilosas, no contexto da planta inteira utilizando plantas compostas, ou após a regeneração das plantas transgênicas.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.50 mL tubes	Eppendorf	125.215
10% solution of commercial bleach	SAVO
1-naphthaleneacetic acid (NAA)	Duchefa	N0903	Callus regeneration medium
2.0 mL tubes	Eppendorf	108.132/108.078
3M micropore tape	Micropore
6-Benzylaminopurine (BAP)	Duchefa	B0904	Callus regeneration medium, Shoot elongation medium
70% ethanol
bacteriological agar	HiMedia	RM201	LB medium
Bacteriological peptone	Oxoid	LP0037	LB and YEB media
Beef extract	Roth	X975.1	YEB medium
Bottles	DURAN	L300025
Cefotaxime sodium	Duchefa	C0111	Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium
chloroform	Serva	3955301
CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide	Sigma	52365
dNTP mix	Thermo Fisher Scientific	R0193
EDTA - Titriplex III, (Ethylenendinitrilo)tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate	Sigma	ES134-250G
elctroporation cuvette
electrophesis agar, peqGOLD universal	VWR	732-2789
electrophoresis chamber	BIO-RAD
electrophoresis gel reader	BIO-RAD
electroporator GenePulser Xcell	BIO-RAD
ethidium bromide	AppliChem
Gene Pulser/MicroPulser electroporation cuvettes, 0.2 cm gap	BIO-RAD	1652082
Gene Ruler DNA ladder mix	Thermo Fisher Scientific	SM0331
Gibberellic acid (GA3)	Duchefa	G0907	Shoot elongation medium
glycerol	Sigma	G5516-1L
HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-pirerazinyl)-ethansulfonique	Merck	1101100250
indole-3-butyric acid (IBA)	Duchefa	I0902	Root induction medium
kanamycin monosulfate	Duchefa	K0126
Magenta GA-7 Plant Culture Box w/ Lid	Plant Media	V8505-100
Measuring cylinder
MES monohydrate	Duchefa	M1503	Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium
Murashige and Skoog medium (MS)	Duchefa	M0237	Medium for germination, Plant growing medium
Murashige and Skoog medium (MS) + B5 vitamins	Duchefa	M0231	Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium
needle Agani 26G x 1/2 - 0.45 x 13mm	Terumo
pH meter
Phytagel	Sigma	P8169	Callus regeneration medium, Root induction medium, Medium for germination
PVP 40 (polyvinylpyrolidone Mr 40000)	Sigma	9003-39-8
Redtaq DNA Polymerase,Taq for routine PCR with inert dye, 10X buffer included	Sigma	D4309-250UN
Retsh mill	Qiagen
sodium chloride	Lachner	30093-APO	LB medium
square Petri Dishes	Corning	GOSSBP124-05
sucrose	Penta	24970-31000	Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium
Syringe filter	Carl Roth	P666.1	Rotylabo syringe filters 0.22 µm pore size
thermomixer	Eppendorf
Ticarcillin disodium	Duchefa	T0180	Hairy root growing medium
Tris(hydroxymethyl)aminomethan	Serva	3719003
ultrapure water	Millipore Milli-Q purified water
Yeast extract	Duchefa	Y1333	LB medium