Este trabalho foi financiado por uma Bolsa de Investigação Wellcome Trust Sênior I. Davis.

1. Preparação Drosophila prévia para dissecção (De acordo com E. Gavis, Princeton University) <ol><li> Descarte os adultos a partir de uma garrafa pouco semeado e transferir o frasco a 25 ° C antes da sua experiência. Uma vez que novos adultos começaram a emergir, esperar dois dias. </li><li> Pegue um frasco contendo aproximadamente 10ml mosca de alimentos sólidos e adicionar 0.5-0.7 gramas de fermento seco (ver tabela) em um ângulo de 45 graus. Não cubra toda a superfície do alimento da mosca com o fermento. </li><li> Adicionar algumas gotas de água para a levedura, suficiente para hidratar (Figura 1A). Colocar o frasco a 45 graus e permitir que cerca de 3 minutos para a levedura para absorver a água (Figura 1B). </li></ol> Nota: Alternativamente, a levedura de pré-mistura um colar em um recipiente separado e adicionar o colar para o frasco com uma espátula. <ol start="4"><li> Anestesiar as moscas no frasco através da injeção de gás de CO 2. Quando eles param de se mover, derrubar as moscas inconscientes para o CO 2 <li> Isolar 10-15 fêmeas e 5 machos do genótipo desejado sob um escopo dissecando com um pincel de ponta fina (Figura 1D). Os machos são óbvias pela presença de claspers, uma estrutura escuro saliente, por sua posterior. </li><li> Adicionar moscas seleccionados para o frasco de yeasted (Figura 1E). Lugar a 25 ° C durante 24-60 horas. Incubar por períodos mais curtos de tempo para um maior percentual de jovens para as câmaras de estágio meados de ovo e longos períodos de tempo para câmaras de ovos em fase tardia. </li></ol> 2. Dissecção ovário Drosophila <ol><li> Colocar uma pequena gota de óleo em um halocarboneto No. 1,5, 22 x 50 lamínula mm (Figura 2A). Ajuste o lamínula preparada para o lado onde não será no caminho. </li><li> Anestesiar as moscas no vil yeasted pela injeção de gás CO 2 e ponta em uma almofada de CO 2. </li><li> Use afiadas bem-cheirados pinça para agarrar um indivíduo do sexo feminino engordados no anterior do abdômen (não entre ªabdómen e tórax e) (Figura 2B-C). </li><li> Segure a fêmea com as pinças e ver sob um microscópio de dissecação, cerca de 2-3 cm acima da lamela preparado. </li><li> Ainda segurando na anterior, utilizar um segundo conjunto de pinça para remover o tecido na posterior extrema do sexo feminino (Figura 2D). Nota: O tecido Gut normalmente irá puxar para fora com a extremidade posterior. Seque a tecido removido das pinças. </li><li> Mantendo o feminino na anterior, use a pinça dizimado a apertar ou massagear o abdômen, trabalhando a partir da anterior para a posterior. Massajar o abdómen da mesma maneira como a remoção de pasta de dentes a partir da extremidade de um tubo. </li><li> Dois grandes estruturas opacas será empurrado a partir do abdómen e vara no final da pinça (Figura 2E F-). Estes são os ovários emparelhados. </li><li> Tocar nos ovários para o óleo de halocarboneto sobre a lâmina abaixo. </li><li> Repita a dissecção 1-2 vezes para dar um total de 4-6 ovários no óleo sobre a lamela (Figure 2G). </li></ol> 3. Ovaríolos Isolando Nota: Cada ovário contém cerca de 16 ovaríolos compostas de 6 a 10 câmaras de ovos de diferentes estágios organizados como contas num fio 10. Nota: Antes do isolamento dos ovaríolos, ajustar a fonte de luz sobre o microscópio de dissecação de modo que a iluminação atinge a um ângulo raso para a amostra. Isto dá contraste com a amostra e permite a visualização das câmaras de ovo jovens fase. <ol><li> No óleo, separar as duas ovários através da remoção do tecido de ligação na extremidade posterior (fases de idade) com uma pinça fechada (Figura 3A). </li><li> Orient ovário um indivíduo com os mais antigos estágios para a fase mais jovem e esquerda para a direita. As câmaras de fase jovem ovo no ovário são transparentes e formar a extremidade mais aguçado do ovário. </li><li> Com uma pinça na mão dominante, gentilmente segure o posterior de um ovário, de preferência pelos restos do diatecido conjuntivo e. Enquanto mantém o ovário no local com a pinça, use uma sonda de dissecação (ou agulha de tungstênio) trazer à tona ovaríolos individuais (Figura 3B-D). </li></ol> Nota: ovaríolos individuais vai quebrar entre as fases jovens (germário para a fase 10), como as fases mais velhos são demasiado grandes para serem separadas do ovário completo. Nota: A perfuração um oócito fase tardia com a sonda de dissecação irá resultar no citoplasma vazando para o óleo e fazer a extracção de ovaríolos individuais muito exigente. Se um oócito fase tardia é perfurada, vá para um ovário fresco. <ol start="4"><li> Uma vez que o ovaríolo é livre do ovário, usar a sonda de dissecação para arrastá-lo para o centro da gota de óleo e orientar na orientação desejada para a experiência. Nota: ovaríolos de petróleo vai se estabelecer e aderir ao vidro. </li><li> Repetir este processo (3,3-3,4), até que existem 15-25 ovaríolos individuais. Nota: Isto pode exigir a dissecção do multiple ovários. Todo o processo deverá ter menos de 15 minutos. </li></ol> Nota: É aconselhável para dissecar cada um ovário de várias moscas em vez de dissecar ambos os ovários de moscas menos para aumentar o número n de moscas para o experimento. Nota: O manuseio indevido do ovaríolo irá resultar em oócitos insalubres e pode levar a artefatos no experimento. Nota: Os oócitos vai começar a exibir alterações fenotípicas devido ao estresse 40 minutos depois de ter sido dissecados a partir do ovário (compare Figura 7E a F). <ol start="6"><li> Uma vez que ovaríolos estão em uma orientação adequada (Figura 3E), usar a sonda de dissecação e pinça fechada para mover o tecido do ovário excesso para fora do óleo. Este material pode ser eliminado a partir da pinça sobre uma toalha de papel. </li></ol> 4. Isolando individuais câmaras nas fases finais de ovo (segundo E. Gavis, Princeton University) <ol><li> Com um par de pinças na Dominformiga mão, segure a parte posterior de um ovário isolado, de preferência pelos remanescentes do tecido conjuntivo. Mantendo o ovário no lugar com os fórceps, introduzir a sonda de dissecação para dentro da extremidade posterior do ovário perto das pinças (Figura 4A). Evite perfurar nenhuma câmara de ovos através da inserção da sonda entre as câmaras de ovos em fase tardia. </li><li> Puxar a agulha de dissecação através do ovário até que ele sai nas câmaras fase inicial de ovo (Figura 4B). Quando feito corretamente, a sonda irá remover o tecido conectivo que mantém as ovaríolos e câmaras de ovos final de etapa no lugar. </li><li> Repita o passo 4,2 até os ovaríolos estão espalhados sobre a lamela. Nota: Quando câmaras de ovos não são mais empilhados em cima uns dos outros, este passo é completa. </li><li> Utilizando a sonda de dissecação, separar os oócitos tardios para permitir fácil para imagiologia (Figura 4C). </li></ol> Nota: A perfuração um oócito enquanto dissecando câmaras de ovo em fase tardia não é tão condenando como com dissecando iovaríolos ndividual para as fases mais jovens. Nota: Para câmaras de estágio de 14 ovos, use a pinça para agarrar os apêndices dorsais de orientação. 5. Preparação para injecção Nota: Para a injeção de oócitos no estágio médio, oriente a ovaríolos perpendicularmente ao eixo longo da lamínula. <ol><li> Ligue o microscópio de imagem [no nosso caso um Core DeltaVision de Precisão Aplicada] e carregar as configurações de imagem apropriadas (Figura 5A-B). </li><li> Ligue o aparelho de injecção (Figura 5C). </li><li> Carregar a agulha de injecção com uma ponta de carga (Figura 5D-E). Soluções a serem injectados deve ser centrifugado brevemente a alta velocidade para evitar depósitos que podem bloquear a agulha de injecção. </li><li> Coloque a agulha de injecção carregado para o injector. Tome cuidado para evitar quebrar a agulha (Figura 5F). </li><li> Para ajudar com agulhas desentupimento, coloque um pequeno pedaço de vidro 2x10 milímetros de um corte ou uma lamela quebradot lado uma da gota de óleo contendo os ovaríolos. Certifique-se este fragmento de vidro é coberto de óleo. Este vidro servirá para ram a ponta da agulha contra para quebrar ou desobstrução da agulha. </li></ol> 6. Injeção de RNA fluorescente Antes de começar: Definir o aparelho de injecção e do manipulador de micro-controlos tais que a agulha de injecção está posicionado sobre o centro do campo de visão. <ol><li> Montar a amostra a ser injectado na platina do microscópio. </li><li> Selecione o objetivo de 20x. Objectivos de ampliação mais elevadas ou mais baixas podem também ser utilizados. </li></ol> Nota: Se estiver usando uma etapa automatizada com capacidade de ponto de visitação é aconselhável marcar todas as fases do 8-9 oócitos para injeção antes de começar. Isto permite a visitar fácil e injecção de oócitos seleccionados. <ol start="3"><li> Abaixe a agulha de injeção, até tocar o óleo. Centro ponta da agulha sobre a lente objetiva. </li><li> Transformarfora as luzes da sala e acender a luz brilhante de campo para o microscópio. Selecione o primeiro ponto (oócitos) na lista de pontos marcados. Ao olhar através das oculares, o foco sobre o oócito (Figura 6A). </li><li> Baixar a agulha manualmente até que está no mesmo plano do foco como o oócito e próxima visível para o oócito. </li><li> Usando os controles de manipuladores, mover o ponto da agulha de injecção até que esteja dentro do oócito. Um movimento rápido esfaquear é muitas vezes mais bem sucedidos do que um avanço lento. Uma vez dentro, ejectar um pequeno volume da agulha e visualmente avaliar os efeitos, repetir, conforme necessário. Se a injecção for bem sucedida, o citoplasma dentro do oócito serão deslocados, se tal não for evidente, de repetição. Não é necessário para a imagem de fluorescência para determinar se o material tenha sido injectado. Após a injecção, remover a agulha do interior do oócito (Figura 6B-G). </li><li> A quantidade exacta de fluido injectado é difícil de quantificar. Para aumentar o volume injetado, adjur a pressão ou o tempo do pulso de injecção, quebrar a ponta da agulha para aumentar a abertura ligeiramente ou usar pulsos a injecção repetida. </li></ol> Nota: O processo de injeção todo deve demorar menos de 10 segundos quando executado corretamente. Extensa facadas ou persistente com a agulha para dentro de oócitos irá resultar em graves danos para a câmara de ovo. <ol start="8"><li> Antes de seleccionar o oócito próxima marcado, elevar o suficiente agulha de injecção de alta no óleo de modo a não contactar oócitos outros no caminho de viagens. </li><li> No ovócito novo, repita o passo 6.6. Continue desta forma até que todos os ovócitos necessários são injetados. </li></ol> Nota: Se um erro é cometido durante a injecção, passar para a próxima marcada oócito. Não perca tempo em oócitos danificadas. Nota: A agulha pode ficar entupido durante uma sessão de injecção. Neste caso, mover a agulha adjacente à peça de vidro quebrado no óleo sobre a lamela. Inteligênciah, o vidro ea agulha no mesmo plano focal, suavemente ram a agulha no vidro (Figura 6H). Teste que a agulha é unclogged pressionando o botão de injecção e ver se qualquer fluido sai do ponta da agulha. <ol start="10"><li> Quando todos os oócitos foram injectados, mover manualmente a agulha para cima, para fora do óleo e orientar-lo para fora do caminho do feixe para o microscópio. Assegure-se que é em uma orientação segura, para evitar danos nos olhos. </li></ol> Nota: Se um período prolongado de tempo decorrido entre o isolamento de ovo câmara de injecção e do oócito, os oócitos será difícil de injectar e exibem alterações fenotípicas associados com o stress. Questões semelhantes podem surgir com a manipulação grosseira do oócito ou injeção de volumes em excesso (comparar Figuras 6I, J, K). 7. Live projeto experimental de imagens <ol><li> Selecione o oócito injetada primeiro da lista. Teste que a injeção estava dentro do oócito por um quadro de imagem de fluorescência (as na Figura 6G). </li><li> Configure os parâmetros experimentais, tais como: comprimento de onda de excitação, o caminho de emissão, tempo de excitação, Z-stack eo tempo entre as coletas. Nota: Para mais informações sobre isso, ver Parton R., et al. (2010) 2. </li><li> Reúna o conjunto de dados. </li></ol> 8. Os resultados representativos In vitro sintetizado Alexa-546 GRK RNA injectado um Me31B :: GFP ovo câmara (Figura 7A). O RNA localiza-se o anterior dorsal do oócito e forma uma tampa em torno do núcleo (Figura 7B). Para mais exemplos de localização RNA ver MacDougall N., et al. (2003) 11. Oócitos no estágio de meados e final expressando a proteína fluorescente etiquetado (Tau-GFP, Figura 7C) ou sistemas de marcação de RNA (GRK * mCherry, Figura 7D) podem ser visualizados sem injeção. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig1.jpg" /> Figura 1. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig2.jpg" /> Figura 2. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig3.jpg" /> Figura 3. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig4.jpg" /> Figura 4. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig5.jpg" /> Figura 5. <img alt="A Figura 6" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig6.jpg" /> Figura 6. <img alt="A Figura 7" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig7.jpg" /> Figura 7.

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Não temos nada a divulgar.

<html> Imagens de células vivas é um ensaio poderoso para examinar os processos celulares em tempo real. Além disso a observação de campo brilhante simples, a adição de etiquetas fluorescentes para proteínas e RNAs de interesse tem levado a muitos avanços. Aqui nós descrevemos um protocolo para oócitos de vida de imagem individuais que podem ser utilizados em combinação com os ensaios genéticos e bioquímicos. Neste protocolo, também explicam como manipular experimentalmente oócitos de vida por injeção. Há muitas possibilidades para o material a injectar, incluindo in vitro sintetizado fluorescentes RNA marcadas para ensaio da capacidade de uma estrutura secundária de RNA para localização directa (Ball e Davis, não publicado) e os anticorpos que inibem a função das proteínas 6. O trabalho futuro provavelmente irá ver a introdução de componentes de rotulagem e outros maquinaria celular para oócitos de vida que permitam mecanismos moleculares a ser testado. t &quot;&gt; Preservar a viabilidade ea saúde do tecido é essencial quando se trabalha com células vivas. Neste protocolo, destacamos uma série de passos que podem levar ao estresse da câmara de ovos. Por exemplo, apesar de óleo sendo superior para imagens, cultura prolongada no óleo podem conduzir ao stress na câmara de ovo. Isto pode ser facilmente monitorizado sob a exposição de campo claro examinando a morfologia nuclear e posição, a membrana de oócitos que irá distorcer e bolha sob stress (comparar Figura 7E (átono) para Figure7F ( salientou)). etapa 9 câmaras de ovo mostram RNA localização e migração de células fronteira 12 horas sobre múltiplos. No entanto, uma fase de 7/8 câmara de ovo vai começar a exibir efeitos nocivos no halo óleo de carbono depois de cerca de 40 minutos do ovário sendo removido do do sexo feminino. câmaras fase tardia de ovo, fase 11 a 14, pode desenvolver-se normalmente em óleo ou meios aquosos por causa da secreção da casca do ovo a partir das células foliculares a estes 13 fases. Tem sido reported que a adição de insulina para meio de insectos aquosa pode manter etapa 9 oócitos por até 6 horas e 14 germaria até 14 horas e 15. Em todos os casos, de manobra agressivo da câmara de ovo deve ser evitada, uma vez que salienta os oócitos e reduz a sua viabilidade. Imagem menos câmaras de ovos e tendo o cuidado de tratar cada delicadamente é a melhor maneira para assegurar a viabilidade ideal.

Ferramentas utilizadas na dissecção deve ser limpo, mas não precisam ser autoclavado. Limpe as ferramentas com ETOH e deixe-os secar antes de começar. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Pincel de ponta fina (Artistas Sable, redondo, tamanho 00 ou 0) </td><td> Disponível a partir de fontes de estabelecimentos mais arte </td><td></td><td> Uma escova de boa qualidade é importante </td></tr><tr><td> Halocarbon Products Corporation, Série 95 </td><td> Halocarbon Products Corporation, 887 Kinderkamack Road, River Edge NJ 07661 </td><td></td><td> Distribuidor europeu: Solvadis (GMBH) Certifique-se oxigenar por borbulhamento de ar através do petróleo. </td></tr><tr><td> Cubra escorregar-No. 1,5, 22 x 50 milímetros </td><td> Internacional-No1-VWR Cat = 631-0137-22-50 milímetros </td><td> Menzel-Glaser-22-40 milímetros-400-070T MNJ </td><td></td></tr><tr><td> Dumont No.5 - Dumostar </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 11253-20 </td><td> &quot;Biologie&quot; dica também é boa, mas mais frágil </td></tr><tr><td> Dissecando sonda </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 10140-01 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de dissecção </td><td> Olimpo </td><td> SZ61 </td><td></td></tr><tr><td> CO2 pad </td><td> Disponível através de <a href="http://www.flystuff.com">http://www.flystuff.com</a> / (A divisão de Genesee Científica) </td><td> 59-114 (789.060 Dutscher) </td><td> Distribuidor europeu: www. dutscherscientific. com</a> / Também é relativamente fácil de costume construir suas próprias almofadas mosca </td></tr><tr><td> KimCare </td><td> Kimbery Clark-KimCare-médicos toalhetes </td><td> KLEW3020 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio DeltaVision- </td><td> Precisão Aplicada </td><td> DC-CORE </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulador </td><td> Micromanipuladores Burleigh da Lumen Dynamics Grupo inc. 2260 Argentia Road, Mississauga, Ontário, Canadá L5N 6H7 </td><td> Burleigh PCS-5000, TS-5000-300 </td><td> <a href="http://www.ldgi-burleigh.com">http://www.ldgi-burleigh.com</a> / (Anteriormente Exfo) </td></tr><tr><td> Aparato de injecção </td><td> Tritech Research, Inc. 2961 Veteran Ave Los Angeles, CA 90064 </td><td> Minj-1 </td><td> Modificado com um suporte para levar Eppendorf Femptotips </td></tr><tr><td> Agulha de injeção </td><td> Eppendorf estéril Femtotips I e II </td><td> 930000043 </td><td> Diversas dicas são melhores para diferentes aplicações </td></tr><tr><td> Carregando dicas 20 uL </td><td> Eppendorf </td><td> 5242956.003 </td><td></td></tr><tr><td> De fermento biológico seco </td><td> Fermento Fleischmann </td><td> # 2192 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparing individual drosophila egg chambers for live imaging

Imagens de células vivas é uma técnica importante aplicado a uma série de tecidos de Drosophila utilizados como modelos para investigar tópicos tais como especificação eixo, a diferenciação das células e organogénese 1. Correta preparação das amostras experimentais é crucial, muitas vezes negligenciada etapa. O objectivo da preparação é para assegurar a relevância fisiológica e para estabelecer as condições de imagem óptimas. Para manter a viabilidade do tecido, é crítico para evitar a desidratação, a deterioração, a hipóxia sobreaquecimento ou meio 2. A Drosophila câmara de ovo é um sistema bem estabelecido para examinar as questões relativas, mas não se limitando, a padronização do corpo, a localização do mRNA e organização do citoesqueleto 3,4. Para câmaras de ovos início e meados de palco, montagem em óleo halocarbono é bom para a sobrevivência na medida em que permite a livre difusão de oxigênio, evita a desidratação e hipóxia e tem excelentes propriedades ópticas para a microscopia. Imenvelhecimento de proteínas fluorescentes é possível através da introdução de transgenes para a câmara de ovo ou injecção física de RNA marcadas, proteínas ou anticorpos 5-7. Por exemplo, a adição de MS2 construções para o genoma de animais permite a observação em tempo real de mRNAs no oócito 8. Estas construções permitem na rotulagem in vivo de ARNm através da utilização do RNA bacteriófago MS2 interacção lacete haste com a sua proteína de revestimento 9. Aqui, apresentamos um protocolo para a extração dos ovários, bem como isolar ovaríolos individuais e câmaras de ovos da Drosophila fêmea. Para uma descrição detalhada de Drosophila oogênese sé Allan C. Spradling (1993, reimpressa 2009) 10.

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Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

O<em&gt; Drosophila</em&gt; Ovo câmara é um excelente modelo para estudar os mecanismos de localização do mRNA. A fim de capturar os eventos dinâmicos que sustentam os processos de localização, resolução de imagem rápida alta de tecido vivo é necessária. Aqui, apresentamos um protocolo para a dissecção e imagens de amostras ao vivo com o mínimo de interrupção.

Preparação Individual Drosophila Ovos Câmaras de imagens ao vivo

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

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Research

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Biology

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

19.2K visualizações.  University of Oxford. O Drosophila Ovo câmara é um excelente modelo para estudar os mecanismos de localização do mRNA. A fim de capturar os eventos dinâmicos que sustentam os processos de localização, resolução de imagem rápida alta de tecido vivo é necessária. Aqui, apresentamos um protocolo para a dissecção e imagens de amostras ao vivo com o mínimo de interrupção.

Vídeo: Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Imagens ao vivo da migração das células da glia no Disco Drosophila Eye Imaginal

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Biologia

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Elaboração de Drosophila Os embriões para Live-Imaging Usando o protocolo gota suspensa

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

Colheita e Preparação Drosophila Os embriões para Gravação eletrofisiológicos e outros procedimentos

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparação de Desenvolvimento e Adultos Drosophila Brains e retina de imagens ao vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

Ressonância paramagnética eletrônica Micro-imagem das Espécies ao vivo para o Mapeamento de oxigênio

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

Imagem vertical de Drosophila Os embriões

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.