Comece preparando soluções-estoque de todos os anticorpos a 2.000 microgramas por mililitro. Em seguida, para cada anticorpo, rotule os tubos de diluição com suas respectivas concentrações, incluindo o nome do anticorpo. Inclua também um tubo em branco para cada anticorpo como controle apenas do veículo PBS-TBN.
Em seguida, adicione 75 microlitros de PBS-TBN a todos os tubos de diluição de anticorpos rotulados como 500 microgramas por mililitro e abaixo, incluindo os tubos de controle apenas do veículo. Para cada anticorpo, pipetar 150 microlitros da solução estoque para o tubo rotulado como 1.000 microgramas por mililitro. Para criar uma série de diluição completa para cada anticorpo, transfira 75 microlitros do tubo de 1.000 microgramas por mililitro para a diluição subsequente mais baixa na série.
Depois, feche o tubo de diluição recém-concluído e faça um breve vórtice. Em seguida, adicione 25 microlitros de anticorpos diluídos nos poços designados de uma placa de microtitulação de 96 poços, seguido pela adição de 25 microlitros de PDL1 humano recombinante biotinilado a cada poço de reação. Cubra a placa de microtitulação com um selo adesivo de folha ou plástico e incube à temperatura ambiente por uma hora com agitação em um agitador de placa orbital a 600 RPM.
Em seguida, diluir as esferas humanas recombinantes acopladas a PD1 para uma concentração de 50.000 contas por mililitro com PBS-TBN. Remova a placa de reação de microtitulação de 96 poços do agitador e descasque o selo da placa adesiva. Adicione 50 microlitros da mistura de esferas acopladas a PD1 humano recombinante a cada poço.
Sele bem a placa e incube por uma hora no escuro à temperatura ambiente em um agitador orbital regulado a 600 RPM. Após a incubação, remova cuidadosamente o selo da placa adesiva. Em seguida, coloque a placa no separador de placa magnética por dois minutos para imobilizar as contas.
Confirme se o ímã e a placa de microtitulação estão conectados com segurança. Vire a placa e descarte o sobrenadante com cuidado. Para lavar o excesso de reagentes de reação das contas, remova a placa de microtitulação do separador de placa magnética e adicione 150 microlitros de PBS-TBN a cada poço.
Depois de remover o selador e imobilizar as contas como demonstrado, confirme se o ímã e a placa de microtitulação estão presos e despejado o sobrenadante. Agora adicione 100 microlitros de solução de trabalho SAPE a cada poço de reação e ressuspenda as contas por pipetagem. Sele a placa e incube-a por uma hora em temperatura ambiente no escuro.
Em seguida, remova cuidadosamente o selador da placa adesiva assim que as contas forem imobilizadas, bem como o ímã e a placa estiverem presos juntos. Despeje suavemente o sobrenadante invertendo a placa. Para lavar o excesso de SAPE das contas, remova a placa de microtitulação do suporte da placa magnética e adicione 150 microlitros de PBS-TBN a cada poço para ressuspender as contas.
Em seguida, imobilize as esferas colocando a placa de microtitulação em um separador de placa magnética por dois minutos. Depois de confirmar que o ímã e a placa de microtitulação estão fixados, inverta a placa e remova o sobrenadante. Em seguida, adicione 100 microlitros de imunoglobulina G conjugada anti-humana ou anti-coelho Brilliant Violet 421 diluída em seus respectivos poços.
Sele a placa e incube-a por uma hora no escuro à temperatura ambiente. Em seguida, imobilize as contas e retire o selador da placa adesiva. Confirme se o ímã e a placa de microtitulação estão presos e despeje o sobrenadante.
Lave o excesso de anticorpos secundários das contas adicionando 150 microlitros de PBS-TBN a cada poço para ressuspender as contas. Em seguida, coloque a placa de microtitulação no separador magnético por dois minutos para imobilizar as contas. Confirme se o ímã e a placa de microtitulação estão firmemente juntos e, em seguida, inverta a placa e despeje o sobrenadante.
Uma vez removido o quarto e último tampão de lavagem, retire a placa de microtitulação do separador magnético de placas. Usando uma pipeta, ressuspenda as contas em 100 microlitros de PBS-TBN por poço. Finalmente, para determinar a intensidade fluorescente mediana de cada reação, leia a placa no sistema de análise de fluxo do repórter duplo com o volume de aspiração ajustado para 50 microlitros, contagem mínima de contas para 100 contas, o tempo limite definido para 40 segundos, intervalo de limite para 7.000 a 17.000 e modo de operação para o repórter duplo.
Todos os quatro anticorpos policlonais antipeptídeo PDL1 bloquearam a interação humana recombinante do PDL1 com o PD1. A porcentagem de inibição dos diferentes anticorpos antipeptídeos anti-PDL1 variou de 48% a 74% na concentração máxima testada de 1.000 microgramas por mililitro. O anticorpo monoclonal de controle positivo atezolizumabe alcançou bloqueio de 92% da interação PD1-PDL1 na concentração máxima testada de quatro microgramas por mililitro.
A análise comparativa de ligação de anticorpos candidatos induzidos por PDL1 a PDL1 humano recombinante indicou que todos os quatro anticorpos policlonais antipeptídeo PDL1 se ligaram a PDL1 humano recombinante de maneira dependente da concentração. O anticorpo anti-PDL1(130) mostrou o maior sinal de ligação RH PDL1 dos quatro candidatos a anticorpos induzidos por vax PDL1.
