As técnicas zymográficas atuais detectam um número limitado de proteases. A zymografia fluorescente do peptídeo usa peptídeos fluorescentes como o substrato degradável que permite a medição de uma maior gama de proteases. A principal vantagem deste método é seu design modular.
A sequência do peptídeo fluorescente determina quais proteases são detectadas e o peptídeo fluorescente pode ser facilmente trocado por um peptídeo de uma sequência diferente, uma capacidade de detectar outros proteases. Esta técnica pode ajudar a informar o design do uso de peptídeos como cruz-linkers degradáveis em biomateriais projetados, como os usados para entrega de medicamentos ou aplicações de engenharia de tecidos. A incorporação desse peptídeo nesta técnica pode identificar proteases secretas teciduais responsáveis pela degradação do biomamaterial.
A demonstração dessa técnica é importante para visualizar a abordagem multicamadas que é única em comparação com outras técnicas de zymografia. Demonstrando essa técnica, Ameya Deshmukh, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para começar, prepare uma solução de gel de resolução de 10%poliacrilamida, conforme descrito na tabela um do protocolo de texto.
Imediatamente antes de derramar o gel, adicione o TEMED e o APS. Em seguida, encha e esvazie o de 1,5 milímetros mini gel no meio do caminho com a solução de gel de resolução. Adicione uma fina camada de isopropanol ao topo do gel de poliacrilamida para produzir um gel nivelado e evitar bolhas.
Use a solução de poliacrilamida restante para acompanhar o progresso da reação de polimerização. Quando o poliacrilamida no tubo se solidificou completamente, a reação está completa. Enquanto a primeira camada de gel de resolução é polimerizadora, recupere o kit Azido-PEG3-Maleimide do armazenamento a 20 graus Celsius e permita que os componentes atinjam a temperatura ambiente.
Em seguida, dissolva os componentes do frasco dois no volume recomendado pelo fabricante de DMSO. E vórtice por 30 segundos para garantir que os líquidos estejam bem misturados. Transfira o conteúdo do frasco um em um frasco fundo redondo limpo e seco de 100 miluletos que contenha uma barra de mexida.
Insira imediatamente uma rolha de septo de borracha com um diafragma que pode ser perfurado com uma seringa na boca do frasco. Em seguida, insira duas agulhas de seringa de calibre 18 no diafragma. Conecte uma das agulhas de seringa a um tanque de gás inerte e deixe o gás encher o frasco fundo redondo por três minutos.
Em seguida, desligue o gás inerte e desprende-o da agulha. Usando uma seringa, injete o conteúdo completo do frasco dois no frasco. Remova as agulhas e a seringa.
Deixe os componentes se misturarem por 30 minutos à temperatura ambiente enquanto mexem. Depois disso, remova a rolha de septo de borracha e transfira o conteúdo para um tubo de centrífuga de cinco mililitros limpos. Uma vez que a primeira camada de gel de resolução tenha polimerizado despeje a camada isopropanol.
Pipet um mililitro de água desionizada em cima do gel e, em seguida, despeje a água para enxaguar o gel. Recupere o peptídeo fluorescente funcionalizado de tiol do armazenamento a 80 graus Celsius. Deixe descongelar à temperatura ambiente.
Prepare uma solução de gel 10% resoluta contendo a molécula de linker Azido-PEG3-Maleimide e o peptídeo fluorescente conforme descrito na tabela um do protocolo de texto. Imediatamente antes de derramar o gel adicione o TMED e o APS. Em seguida, encha metade da parte restante do de gel com a solução de gel de resolução de peptídeos.
Adicione uma fina camada de isopropanol ao topo do gel de poliacrilamida para produzir um gel nivelado e evitar bolhas. Use a solução de poliacrilamida restante para acompanhar o progresso da reação de polimerização. Depois que a reação estiver completa, despeje a camada isopropanol.
Pipet um mililitro de água desionizada em cima do gel e, em seguida, despeje a água para enxaguar o gel. Se não usar os géis imediatamente, armazene-os imergindo-os em uma caixa de plástico cheia de 100 mililitros de 1x PBS a quatro graus Celsius. Enrole a caixa em papel alumínio para evitar fotobleaching.
Primeiro, prepare uma solução de gel de empilhamento de 5%, conforme descrito na tabela um do protocolo de texto. Imediatamente antes de derramar o gel adicione o TMED e o APS. Encha a parte vazia restante do de gel com a solução de gel de empilhamento.
Insira rapidamente um pente de gel de 1,5 milímetros na camada de gel de empilhamento, certificando-se de que nenhuma bolha permaneça presa sob os poços. Use a solução de poliacrilamida restante para acompanhar o progresso da reação de polimerização. Quando a reação estiver completa, remova suavemente o pente e a fita da parte de trás do de gel.
Para começar, dissolva amostras no tampão de amostra de zimografia convencional. Adicione 400 mililitros os 1X tris glycene SDS executando buffer ao aparelho de gel. Carregue até 35 microliters de amostra por poço.
Execute as amostras a 120 volts a quatro graus Celsius por uma hora e meia ou até que os padrões de peso molecular indiquem que os proteases de interesse estão dentro da camada de gel que resolve o peptídeo. Depois disso, remova os géis do de plástico. Lave os géis três vezes em tampão de re-naturing à temperatura ambiente sob agitação suave.
A cada lavagem, com duração de 10 minutos. Transfira os géis para uma solução tampão em desenvolvimento por 15 minutos. Em seguida, substitua a solução por um novo tampão em desenvolvimento e incubar a 37 graus Celsius sob suave agitação por 24 horas.
Depois disso, use um imager de scanner de gel fluorescente com os filtros de excitação e emissão apropriados para a imagem dos géis. Neste estudo, peptídeos fluorescentes são incorporados em géis de poliacrilamida. QGIW é uma sequência derivada de colágeno projetada para detectar colagem celular, enquanto LACW é uma sequência que foi otimizada para a detecção de MMP-14 e MMP-11.
Imagens fluorescentes revelam numerosas bandas dentro dos géis de peptídeos LACW, enquanto apenas uma única banda é vista nos géis QGIW. Quando comparados à zymografia de gelatina, os géis LACW são capazes de detectar bandas mais proteolíticas, o que demonstra a capacidade da zymografia de peptídeos de detectar uma gama mais ampla de proteases presentes dentro de amostras biológicas do que os métodos tradicionais usando substratos nativos. As células de zymografia de peptídeos são então incubadas em tampão de desenvolvimento contendo GM6001, um inibidor de MMP de amplo espectro, ou E64, um inibidor geral de catepsina.
O tratamento dos géis de peptídeo LACW com GM6001, diminui a intensidade das bandas. Enquanto o tratamento com E64 não tem efeito perceptível. O tratamento dos géis de peptídeos QGIQ com GM6001 resulta em ablação completa das bandas vistas anteriormente.
Enquanto o E64 não tem efeito. A zymografia de gelatina é conduzida utilizando MMP-9 purificado e ativado para comparar a sensibilidade da zymografia de peptídeo com o padrão-ouro atual. Os géis LACW são capazes de detectar as menores concentrações de MMP-9.
As proteases requerem condições específicas para re-natureza e se tornam ativadas. Prepare cuidadosamente as soluções de buffer para garantir que a composição e o PH estejam corretos. Este método pode ser complementado por técnicas existentes para verificar a identidade e realizar uma análise mais aprofundada das proteases medidas.
Isso inclui manchas ocidentais, PCR em tempo real e espectrometria de massa. Tenha cuidado ao manusear poliacrilamida. A solução não despolmerizada é considerada uma neurotoxina potente e equipamentos de proteção individual adequados devem ser sempre usados ao manuseá-la.
