Para extrair metabólitos intracelulares do holobiont liofilizado adicionar 400 microlitros de metanol 100% frio com padrões internos ao holobionte liofilizado. Em seguida, adicione 10 miligramas de contas de vidro lavadas com ácido e coloque o tubo em um moinho de contas pré-refrigerado. Introduzir a 50 hertz durante três minutos.
Após a lise, adicione 600 microlitros de metanol frio e vórtice por um minuto. Coloque o tubo em um agitador rotisserie a quatro graus Celsius por 30 minutos. Para extrair metabólitos de células symbiodiniacae liofilizadas separadas, adicionar 200 microlitros de metanol frio com padrões internos às células secas de symbiodiniacae.
Em seguida, adicione contas de vidro lavadas com ácido e coloque o tubo em uma pastilha de moinho de contas pré-refrigerada a 50 hertz. Após três minutos, adicione 800 microlitros de metanol e vórtice por 30 segundos. Para extração de metabólitos do tecido hospedeiro liofilizado separado, adicione um mililitro de metanol frio contendo padrões internos ao material hospedeiro seco e vórtice por 20 segundos.
Em seguida, coloque o tubo em um suporte de tubo flutuante para sonicação a quatro graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, para purificação do extrato de metabólito, centrifugar todas as amostras a 3000G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de dois mililitros sem perturbar o pellet.
Ressuspenda o pellet em um mililitro de metanol 50% frio e vórtice vigorosamente por um minuto. Centrifugar novamente, em seguida, coletar e agrupar os extratos polares sobrenadantes com os extratos semipolares da mesma amostra. Centrifugar os extratos agrupados a 16, 100G por 15 minutos para remover os precipitados.
Para análise, aliquote 50 microlitros de cada extrato em uma pastilha de vidro e concentre-se usando um concentrador a vácuo por 30 minutos a 30 graus Celsius. A análise do GCMS revelou 107 metabólitos anotados em todos os tratamentos, incluindo um conjunto de aminoácidos, ácidos orgânicos, carboidratos, ácidos graxos e estéreis. K significa que o agrupamento identificou três agrupamentos distintos de amostras.
As amostras de holobionte foram intermediárias entre as frações hospedeira e simbionte separadas. Embora K signifique distribuições de agrupamento, coordenadas paralelas e visualização do mapa de calor no metabólito, a abundância relativa indicou que o perfil de holobionte mais próximo do perfil da fração hospedeira diferiu significativamente dos perfis de hospedeiro e simbionte. Os perfis hospedeiro e simbionte foram significativamente distintos entre si, com 100 metabólitos individuais, significativamente diferentes entre as frações hospedeira e simbionte.
