IPSC Differentiation into Posterior Primitive Streak and Nephrogenic Intermediate Mesoderm

Comece lavando as células-tronco pluripotentes induzidas ou iPSCs na placa de 6 poços revestida com matriz de membrana com DPBS de dois mililitros. Aspirar o DPBS usando uma pipeta. Em seguida, adicione um mililitro da solução de descolamento celular disponível comercialmente para separar as iPSCs.

Em seguida, coloque a célula em uma incubadora a 37 graus por cinco minutos. Agora pipete um mililitro de mTeSR para as iPSCs, garantindo que as células tenham se separado da superfície plástica. Centrifugar estas células a 400g durante três minutos à temperatura ambiente.

Ressuspenda a pastilha de células e, em seguida, conte o número de células usando um hemocitômetro. Em seguida, semeie uma gama de densidades celulares em uma placa de 6 poços que foi revestida com uma matriz de membrana. Cultura destes com mTeSR suplementado com 10 inibidor micromolar de Rho-quinase.

Cultive as placas durante a noite em uma incubadora de dióxido de carbono fixada a 37 graus Celsius. No dia seguinte, aspirar o mTeSR e lavar as células com dois mililitros de DPBS. Em seguida, adicione dois mililitros de meio estágio 1 às células.

Em seguida, coloque as células em uma incubadora de 37 graus Celsius por quatro dias. No quarto dia, remova o meio estágio 1 e lave as células com dois mililitros de DPBS. Em seguida, adicione dois mililitros de meio estágio 2 às células antes de incubar as células como antes.

Do dia zero ao quarto dia, as iPSCs rapidamente se expandiram e assumiram formas romboides ou triangulares. A confluência atingiu 90 a 100% e acumulou-se uniformemente até o sétimo dia. Após a cultura da suspensão, os agregados formam espontaneamente estruturas néfrons após dissociação no sétimo dia.