Para começar, adicione 70 microlitros de tampão condicionante para cada mililitro da infração do humor ocular sem células. Vórtice as contas de limpeza para misturar completamente. Em seguida, adicione as contas à amostra e, em seguida, vomite a amostra e as misturas de contas.
Centrifugar esta mistura a 3000 G durante 15 minutos à temperatura ambiente. Sem deslocar o pellet, extraia o supernato e, em seguida, adicione um volume igual de tampão de digestão do pellet de urina ao pellet. Pipetar a solução para cima e para baixo para ressuspender o pellet.
Agora adicione proteinase K à mistura de pellets ressuspensos. Incubar a mistura a 55 graus Celsius durante 30 minutos e, em seguida, adicionar um volume igual de tampão de lise genómica à mistura de digestão. Vórtice bem a solução para misturá-la bem.
Agora, coloque a coluna de spin disponível comercialmente em um novo tubo de coleta. Adicione 200 microlitros de tampão de preparação de DNA urinário à coluna de rotação. Centrifugar a 16.000 G durante um minuto à temperatura ambiente e eliminar o fluxo.
Agora pipetar 700 microlitros de DNA urinário lava tampão para a coluna e centrífuga como demonstrado. Depois de descartar o fluxo, transfira a coluna de spin para um tubo de microcentrífuga DNase, livre de RNase. Por último, adicione o volume apropriado de tampão de eluição de ADN directamente à matriz da coluna e deixe-o descansar durante três a cinco minutos à temperatura ambiente e, em seguida, centrifugar novamente para obter ADN livre de células.
Os rendimentos de DNA de ambos os componentes celulares e livres de células dos fluidos oculares foram semelhantes. Foi realizada análise por PCR dos componentes celulares e livres de células de uma mutação associada ao linfoma vitreorretiniano. Uma maior taxa de mutação estava presente no componente livre de células, como demonstrado por um limiar de ciclo reduzido.
