1 2 Para começar, veja as células HEK 293T3 24 horas antes da transfecção 4 em um prato de 15 centímetros contendo GMEN. 5 Incube as células a 37 graus Celsius 6 e 5% de dióxido de carbono 7 até atingirem 40 a 50% de confluência. 8 Rotule três tubos de plástico de 15 mililitros 9 com o nome apropriado do lentivírus.
10 Adicione 1.710 mililitros de meio de soro reduzido 11 e 90 microlitros de reagente de transfecção a cada tubo. 12 Misture o conteúdo por vórtice 13 antes de incubar os tubos à temperatura ambiente. 14 Após cinco minutos, adicione a mistura do vetor de embalagem 15 ao meio de transfecção e ao vórtice.
16 Em seguida, adicione 7,5 microgramas de vetor de reprogramação 17 e o controle pWPT-GFP 18 à respectiva mistura de transfecção. 19 Vortex os tubos por dois segundos 20 antes de incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. 21 Para transfectar as células 293T com cada lentivírus, 22 gota a gota, adicione uma mistura de DNA de transfecção no prato.
23 Incubar as células transfectadas a 37 graus Celsius 24 e 5% de dióxido de carbono. 25 Após 14 a 16 horas, 26 substitua o meio por 30 mililitros 27 de meio fresco 293T 28 e continue a incubação por 60 a 72 horas. 29 Observe as células diariamente 30 e verifique a eficiência da transfecção.
31 Em seguida, transfira a cultura de transfecção do vírus 32 para tubos de 15 mililitros 33 e gire a 1.932 G por 10 minutos 34 a quatro graus Celsius. 35 Filtre o sobrenadante lentiviral 36 usando um filtro de seringa de 0,45 mícron 37 em um novo tubo de 50 mililitros. 38 Um dia antes da transdução do lentivírus, 39 preparam dois poços de uma placa de 6 poços 40 contendo 100.000 células PDAC por poço.
41 Prepare dois tubos de 15 mililitros 42 com dois mililitros de meio PDAC pré-aquecido. 43 No primeiro tubo, 44 adicionam 12 mililitros de lentivírus de reprogramação. 45 Em seguida, adicione 12 microlitros de polibreno 46 e misture por pipetagem.
47 Ao segundo tubo, 48 adicione dois microlitros de polibreno. 49 Agora remova cuidadosamente o meio de cada poço 50 de uma placa de 6 poços 51 e lave uma vez com PBS em temperatura ambiente. 52 Adicione o meio de infecção de reprogramação 53 do tubo um ao primeiro poço.
54 Adicione a mistura do tubo dois ao segundo poço. 55 Incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius 56 com 5% de dióxido de carbono e 5% de oxigênio. 57 No dia seguinte, substitua o meio 58 de ambos os poços pelo meio PDAC fresco 59 e continue a incubação 60 por até 48 horas, conforme demonstrado.
