A.S 和 J.K 感谢英国癌症研究中心和 OHSU 的资助（CRUK-OHSU 项目奖 C65925/A26986）。A.S 获得 MRC 职业发展奖 （MR/N024028/1） 的支持。A.A.由阿卜杜勒阿齐兹国王科技城的博士奖学金（奖学金参考1078107040）资助。J.K 由 MRF 新研究者资助 （GCNCR1042A） 和 Knight CEDAR 资助 （68182-933-000， 68182-939-000）。我们感谢Keisuke Kaji教授提供重编程载体pSIN4-EF1a-O2S和pSIN4-CMV-K2M。出于开放获取的目的，作者已将知识共享署名 （CC BY） 许可应用于本提交的任何作者接受的手稿版本。

所有实验方案均已获得OHSU机构审查委员会的批准。所有方法均按照相关准则和规定进行。所有针对 PDX 肿瘤的动物工作均在 OHSU 机构动物使用和护理委员会 （IACUC） 的批准下进行。该方案在来自患者来源的异种移植物 （PDX） 的原代 PDAC 细胞、从 61 岁女性腺癌患者的胰腺组织中分离出的具有上皮形态的 BxPc3 细胞系、源自正常人胰管上皮的 H6C7 永生化上皮细胞系和源自健康个体皮肤活检的原代人成纤维细胞进行了测试。人类PDAC标本是在俄勒冈州胰腺组织登记研究（IRB00003609）下获得的。获得所有受试者的知情同意。人类原代成纤维细胞来自英国爱丁堡的RBiomedical，来自在英国小法兰西爱丁堡皇家医院接受常规手术的匿名捐赠者的皮肤样本，经其同意和伦理批准（09/MRE00/91）。所有慢病毒工作均在2级研究活动（GM207/16.6）下进行，并得到爱丁堡大学健康与安全系的批准，并通知苏格兰政府的HSE主管当局。所有使用人类胰腺细胞的重编程实验都是在爱丁堡大学生物科学学院伦理委员会的伦理批准下进行的（参考文献#asoufi-0002）。
1.慢病毒的制备
<ol><li>对于慢病毒制备，制备浓度在1-2μg/μL之间的高质量包装和表达质粒（无内毒素），包括psPAX2、pMDG34和两种含RES的双反子载体;由 EF-1α 启动子驱动的 OCT4 和 SOX2 表达的 pSIN4-EF1a-O2S 编码，以及 CMV 增强子/启动子35 下 KLF4 和 c-MYC 表达的 pSIN4-CMV-K2M（参见 材料表）。此外，制备用作转染对照的pWPT-GFP质粒。</li>
	<li>解冻人胚胎肾细胞系（293T）并在格拉斯哥的最低必需培养基（GMEM）中培养，补充10%胎牛血清（FCS），1x非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠和1mM谷氨酰胺，温度为37°C和5%CO2（参见材料表）。 注意：建议在解冻后四次传代内使用 293T 细胞。</li>
	<li>在转染前 24 小时，每 15 cm 培养皿的密度为 300 万个细胞，接种 293T。总共需要三道菜。最好在下午晚些时候~16：00播种细胞。</li>
	<li>第二天（~16：00），当细胞达到~40%-50%汇合度时，为三种转染反应准备以下材料： 注意：始终通过额外增加 10% 的体积来考虑移液错误。<ol><li>用适当的慢病毒名称（pSIN4-EF1a-O2S、pSIN4-CMV-K2M 和 pwPT-GFP 对照）标记三个 15 mL 塑料管。向每个试管中加入 1.710 mL 还原血清培养基（参见 材料表）。</li>
		<li>将90μL转染试剂（参见 材料表）稀释在1.710mL还原血清培养基中，通过顶点混合2秒，并在室温下孵育5分钟。</li>
		<li>混合包装载体;5.1 μg psPAX2 和 2.4 μg pMDG（总计 7.5 μg）。</li>
		<li>将包装载体混合物加入转染培养基中（从步骤1.4.2开始）并涡旋2秒。</li>
		<li>将 7.5 μg 每种重编程载体：pSIN4-EF1a-O2S 和 pSIN4-CMV-K2M 以及 pwPT-GFP 对照品加入步骤 （1.4.4） 的转染混合物中，涡旋 2 秒。 注意：以 1：1 的比例使用表达载体：病毒载体。</li>
	</ol></li>
	<li>将转染管在室温下孵育 15 分钟。</li>
	<li>通过将步骤（1.4.5）中的转染-DNA混合物以滴滴方式直接加入培养基中，将每种慢病毒的293T细胞转染。旋转培养皿以确保均匀分布在整个表面上。</li>
	<li>将转染的细胞在37°C，5%CO2 培养箱中孵育过夜。 注意：使用病毒专用废物、金属处理桶、带高压灭菌袋的双层袋，并取一个液体废物容器来装病毒并添加消毒片。将所有移液器、吸头和试管丢弃在金属桶中。将旧培养基丢弃到病毒液体废物容器中。避免使用玻璃移液管和玻璃器皿，以消除意外的病毒污染。</li>
	<li>转染后 14-16 小时后，用 30 mL 新鲜 293T 培养基替换培养基。</li>
	<li>将转染的细胞在37°C，5%CO2 下孵育培养基更换后60-72小时。每天观察细胞，并通过GFP荧光检查转染效率。 注意：理想情况下，GFP的转染效率应为>90%。对于其他病毒，应该观察到293T细胞的明显形态变化，因为它们在产生病毒颗粒时往往会变得更加圆润。</li>
	<li>将来自每个病毒转染培养物的培养基收集到50mL管中，并在4°C下以1932× g 清除细胞碎片10分钟。</li>
	<li>通过 0.45 μM 注射器过滤器过滤每个慢病毒上清液，以去除较小的碎片并将其收集到新的 50 mL 管中。</li>
	<li>将每种慢病毒上清液分成 6 mL 等分试样，并在液氮中快速冷冻。</li>
	<li>将慢病毒等分试样储存在-80°C直至准备使用。</li>
</ol>2. 重编程慢病毒转导
<ol><li>在37°C，5%CO2和5%O2 （缺氧）培养箱中解冻原代PDAC细胞并在完全确定的角质形成细胞血清游离培养基（KSFM）中培养，补充有牛垂体提取物（BPE），5ng / mL的人重组表皮生长因子（EGF）和50ng / mL的霍乱毒素（参见 材料表）。</li>
	<li>解冻 BxPc3，一种鳞状胰腺导管腺癌细胞系，并在 RPMI 1640 培养基中培养，在 37 °C 下补充有 10% 胎牛血清 （FCS） 和 5% CO2。</li>
	<li>解冻 H6C7 细胞、胰腺导管上皮细胞，并在 37 °C、5% CO2 下以 5 ng/mL 和 5% CO 2 的浓度补充有 BPE 和 EGF 的 KSFM 中培养。</li>
	<li>在37°C和5%CO2下解冻人成纤维细胞（hFib）并在格拉斯哥最低必需培养基（GMEM）中培养，补充有10%FCS，1x非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠和1mM谷氨酰胺以及0.05mM（最终）β-巯基乙醇。</li>
	<li>在慢病毒转导前一天（最好是下午晚些时候），准备两个孔的 6 孔板，每孔包含 100,000 个细胞，每个孔包括 PDAC、BxPc3、H6C7 和 hFib 细胞。用OSKM慢病毒感染一个孔，并将第二个孔用作未感染的对照。 注意：对每种细胞类型使用单独的板。</li>
	<li>第二天下午（大约24小时后），确保细胞汇合度达到至少70%，然后再进行下一个慢病毒感染步骤。</li>
</ol>3. PDAC的慢病毒转导
<ol><li>在37°C病毒培养箱中解冻5mL每种慢病毒上清液。</li>
	<li>准备两个 15 mL 试管，每个试管含有 2 mL 预热的 PDAC 培养基。</li>
	<li>在第一个试管中，加入 6 mL 每种重编程慢病毒（pSIN4-CMV-K2M 和 pSIN4-EF1a-O2S）和 12 μL 4.5 mg/mL 聚凝聚烯（最终 4.5 μg/mL，参见 材料表）并混合。</li>
	<li>在第二个试管中加入 2 μL 4.5 mg/mL 聚凝聚烯（最终 4.5 μg/mL）。</li>
	<li>弃去每个孔中的培养基，并在室温下用PBS洗涤一次。</li>
	<li>将重编程感染培养基（管 1）加入第一个孔中。</li>
	<li>将管2的混合物加入第二个孔中。这将是未感染的对照。</li>
	<li>将PDAC细胞在37°C，5%CO2和 5%O2 （缺氧）培养箱中孵育过夜。</li>
	<li>第二天下午，从两个孔中丢弃培养基，并用新鲜的PDAC培养基代替。</li>
	<li>将细胞在37°C，5%CO2和 5%O2 （缺氧）下孵育48小时。</li>
</ol>4. 慢病毒转导BxPc3细胞
<ol><li>在37°C病毒培养箱中解冻3mL每种慢病毒上清液。</li>
	<li>准备两个 15 mL 试管，每个试管含有 2 mL BxPc3 培养基。</li>
	<li>在第一个试管中，加入 3 mL 每种重编程慢病毒（pSIN4-CMV-K2M 和 pSIN4-EF1a-O2S）和 6 μL 4.5 mg/mL 聚凝聚烯（最终 4.5 μg/mL）并混合。</li>
	<li>在第二个试管中加入 2 μL 4.5 mg/mL 聚凝聚烯（最终 4.5 μg/mL）。</li>
	<li>弃去每个孔中的培养基，并用PBS洗涤一次。</li>
	<li>将重编程感染培养基（管 1）加入第一个孔中。</li>
	<li>将管2的混合物加入第二个孔中。这将是未感染的对照。</li>
	<li>将感染的BxPc3细胞在37°C病毒和5%CO2 下孵育过夜。</li>
	<li>第二天下午，从两个孔中丢弃培养基，并用新鲜的BxPc3培养基代替。</li>
	<li>将细胞在37°C和5%CO2 下孵育48小时。</li>
</ol>5. 慢病毒转导H6c7细胞感染
<ol><li>在37°C病毒培养箱中解冻4mL每种慢病毒上清液。</li>
	<li>准备两个 15 mL 试管，每个试管含有 2 mL H6c7 培养基。</li>
	<li>在第一个试管中，加入 4 mL 每种重编程慢病毒（pSIN4-CMV-K2M 和 pSIN4-EF1a-O2S）和 8 μL 4.5 mg/mL 聚凝聚烯（最终 4.5 μg/mL）并混合。</li>
	<li>在第二个试管中加入 2 μL 4.5 mg/mL 聚凝聚烯（最终 4.5 μg/mL）。</li>
	<li>从两个孔中弃去培养基，并用PBS洗涤一次。</li>
	<li>将重编程感染培养基（管 1）加入第一个孔中。</li>
	<li>将管2的混合物加入第二个孔中。这将是未感染的对照。</li>
	<li>将感染的H6C7细胞在37°C病毒和5%CO2 下孵育过夜。</li>
	<li>第二天下午，从两个孔中丢弃培养基，并用新鲜的 H6c7 培养基替换它们。</li>
	<li>将细胞在37°C和5%CO2 下孵育48小时。</li>
</ol>6. 慢病毒转导hFib细胞
<ol><li>在37°C病毒培养箱中解冻2mL每种慢病毒上清液。</li>
	<li>准备两个 15 mL 试管，每个试管含有 2 mL hFib 培养基。</li>
	<li>在第一个试管中，加入 2 mL 每种重编程病毒（pSIN4-CMV-K2M 和 pSIN4-EF1a-O2S），并加入 4 μL 4.5 mg/mL 聚凝聚烯（最终 4.5 μg/mL）并混合。</li>
	<li>在第二个试管中加入 2 μL 4.5 mg/mL 聚凝聚烯（最终 4.5 μg/mL）并混合。</li>
	<li>弃去每个孔中的培养基，并用PBS洗涤一次。</li>
	<li>将重编程感染培养基（管 1）加入第一个孔中。</li>
	<li>将管2的混合物加入第二个孔中。这将是未感染的对照。</li>
	<li>将感染的hFib细胞在37°C和5%CO2 下孵育过夜。</li>
	<li>第二天下午，从两个孔中丢弃培养基，并用新鲜的hFib培养基代替。</li>
	<li>将细胞在37°C和5%CO2 下再孵育48小时。 注意：为了有效的慢病毒转导，请小心滴定慢病毒的量，因为这在不同细胞类型之间差异很大。某些细胞类型可能需要多次慢病毒转导。PDAC 细胞系最多需要三剂，而一剂足以重编程 BxPc3、H6C7 和 hFib 细胞系。</li>
</ol>7. iMEF饲养细胞的制备
<ol><li>用 PBS 稀释 1% 明胶储备溶液，制备 40 mL 0.2% 明胶溶液。</li>
	<li>用 2 mL 0.2% 明胶溶液覆盖四个 6 孔板，覆盖每个孔板。</li>
	<li>将明胶包被的板在37°C和5%CO2 下孵育至少30分钟。</li>
	<li>吸出多余的明胶溶液，让板在流罩下干燥。</li>
	<li>通过在37°C水浴中旋转来解冻两瓶（每瓶~400万个细胞）辐照的小鼠胚胎成纤维细胞（iMEFs）。 注意： 为减少污染的可能性，请注意防止水溅到盖子开口附近。用纸巾擦干小瓶，然后喷洒70%乙醇。</li>
	<li>在组织培养罩中，将每个解冻的 iMEFs 小瓶的内容物以滴式方式移液到一个装有 10 mL 预热 hFib 培养基的 15 mL 试管中，并通过轻轻倒置试管充分混合。</li>
	<li>在室温下以309× g 旋转细胞悬浮液3分钟，并从每个管中除去上清液。将每个细胞沉淀重悬于 12 mL hFib 培养基中。</li>
	<li>每孔板 2 mL 的细胞悬液，每孔明胶包被的 6 孔板。通过向各个方向轻轻摇晃板来均匀分布细胞。</li>
	<li>将板在37°C和5%CO2 下孵育过夜。 注意：在用于重编程实验之前准备新鲜的iMEF板24小时。</li>
</ol>8. 将受感染的细胞转移到 iMEF 饲养层上
<ol><li>弃去受感染和未感染的PDAC、BxPc3、H6c7和hFib细胞中的培养基。在室温下用PBS洗涤每个孔两次。</li>
	<li>通过向每个孔中加入 0.5 mL 胰蛋白酶将细胞从板中解离。将PDAC细胞在37°C，5%CO2和 5%O2 （缺氧）培养箱中孵育15分钟。</li>
	<li>将BxPc3细胞在37°C和5%CO2 下孵育5分钟。</li>
	<li>将H6c7和hFib细胞在37°C和5%CO2 下孵育4分钟。</li>
	<li>将解离的细胞悬液从每个孔转移到 15 mL 管中，相应地标记为感染或未感染。</li>
	<li>通过离心收获细胞，如下所示：对于PDAC，将细胞悬浮液以300× g 旋转5分钟;对于BxPc 3，将细胞悬液以120× g 旋转5分钟;对于H6C7，将细胞悬浮液以112× g 旋转4分钟;对于hFib，将细胞悬液以161× g 旋转3分钟。在室温下进行所有离心。</li>
	<li>将每种细胞类型沉淀重悬于 1 mL 适当的培养基中。</li>
	<li>用每种细胞类型培养基洗涤步骤7中制备的iMEF板两次。即，用PDAC培养基洗涤一个板，用BxPc3培养基洗涤一个板，用H6C7培养基洗涤一个板，用hFib培养基洗涤另一个板。</li>
	<li>在 iMEF 6 孔板的 5 个孔中每孔板 50,000 个感染细胞。将 50,000 个未感染的对照细胞培养在 iMEF 6 孔板的剩余一个孔中。 注意：优化要接种的感染细胞数量，从每孔 1,000 个细胞增加到 50,000 个细胞。</li>
	<li>将PDAC细胞在37°C，5%CO2和5%O2 （缺氧）下孵育过夜。</li>
	<li>将BxPc3，H6C7和hFib细胞在37°C和5%CO2 下孵育过夜。</li>
	<li>第二天，按如下方式制备重编程培养基：将 100 mL 敲除血清替代物（25% 最终）、5 mL 200 mM 谷氨酰胺（1 mM 最终）、5 mL 100x 非必需氨基酸（100 μM 最终）、1.5 mL β-巯基乙醇（0.1 mM 最终）加入 400 mL 改性 Eagle 培养基 （DMEM）。</li>
	<li>将重编程培养基在 100 mL 等分试样中储存在 4 °C 下长达 4 周或在 -20 °C 下储存更长时间。</li>
	<li>准备使用时，将 100 μL 10 mg/mL 碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF）（10 ng/mL 最终试样）加入一个 100 mL 重编程培养基等分试样中。</li>
	<li>在37°C水浴中加热重编程培养基。</li>
	<li>用预热的重编程培养基洗涤在iMEFs饲养器上生长的细胞两次。 向每个孔中加入 2 mL 重编程培养基。</li>
	<li>将重编程板转移到37°C，5%CO2和3%O2 （缺氧）培养箱中。 注意：添加重新编程媒体的那一天被视为重新编程的第 1 天。</li>
	<li>每天用新鲜的重编程培养基喂养细胞，直到iPSC集落开始出现。 注意：通过其ESC样形态（具有明确边缘的紧凑菌落，由具有高细胞核/细胞质比的细胞组成）来识别iPSC集落。</li>
	<li>每天监测iPSC菌落，在形成足够数量的iPSC菌落后，将它们作为池传代。 注意：确保 iPSC 菌落不会相互接触，因为这会导致分化并影响其长期稳定性。</li>
	<li>为了建立克隆系，将 iPSC 池传代约 5 次，然后选择保持其 ESC 样形态的健壮菌落。</li>
	<li>为了鉴定完全重编程的iPSC菌落，用TRA-160进行活染色（参见 材料表），并从iPSC菌落中收获RNA进行基因表达表征。</li>
</ol>9. iPSC菌落的传代
<ol><li>如步骤7所述，在传代iPSC菌落之前24小时准备足够的iMEF饲养板。</li>
	<li>用预热的重编程培养基清洗 iMEF 进料板两次。</li>
	<li>向 iMEF 板的每个孔中加入 2 mL 补充有 ROCK 抑制剂 （Y2） （10 μM） 的重编程培养基。</li>
	<li>将iMEF板在37°C，5%CO2和 3%O2 培养箱中孵育，直到准备使用。</li>
	<li>通过在PBS中以1：1000稀释0.5M EDTA（0.5mM最终）来制备乙二胺四乙酸/磷酸盐缓冲盐水（EDTA / PBS）溶液。</li>
	<li>在每个孔中用 0.5 mL EDTA/PBS 替换重编程培养基。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO2 和 3% O2 培养箱中或在室温下孵育，具体取决于细胞类型。BxPc3和PDAC iPSC需要在37°C下孵育15分钟。 H6C7 和 hFib iPSC 需要在室温下孵育 5 分钟。</li>
	<li>在显微镜下检查iPSCs细胞，直到它们开始在整个菌落中均匀地与饲养层解离。</li>
	<li>将解离的 iPSC 细胞悬液收集到 15 mL 离心管中。在室温下以300× g 旋转5分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于补充有Y2（10μM）的1mL重编程培养基中。</li>
	<li>通过将每 1 mL iPSC 细胞悬液转移到 iMEF 板的三个孔中，将细胞板板在 iMEF 饲养层上。 注意：分割率可能因收获的 iPSC 菌落数量而异。</li>
	<li>在37°C，5%CO2 和3%O2 培养箱中孵育。</li>
</ol>10. 用 TRA-1-60 对 iPSC 菌落进行活染色
<ol><li>在重编程培养基中每孔制备 0.5 mL 4 μg/mL TRA-1-60 抗体。</li>
	<li>弃去重编程培养基，并在每个孔中用 0.5 mL 抗体混合物替换。在37°C，5%CO2 和3%O2 培养箱中孵育30分钟。</li>
	<li>用重编程培养基洗涤细胞两次。</li>
	<li>使用 GFP 滤光片通过细胞成像系统捕获荧光图像。</li>
	<li>通过考虑负控制通道来检查图像质量。</li>
</ol>

将 PDAC 和胰腺细胞重编程为诱导多能干细胞

作者声明没有利益冲突。

为了促进使用 iPSC 重编程来研究癌症进展，已经建立了一个用于重编程胰腺癌细胞的稳健方案。到目前为止，将癌细胞重编程为多能性已被证明非常具有挑战性，因为只有少数研究成功地从癌细胞中生成了iPSC 32、36、37、38、39、40、<sup class=...

胰腺导管腺癌 （PDAC） 是最致命的恶性肿瘤之一，由于该疾病的无症状性质，早期诊断仍然具有挑战性。大多数PDAC患者在晚期转移期被诊断为晚期转移期，此时可用的治疗选择非常有限1,2。这主要是由于早期阶段缺乏可靠的生物标志物，例如那些可以方便地检测为释放到血液中的蛋白质的生物标志物。
PDAC可以在其进展的早期播散，当PDAC位于胰腺时，更好的预后与早期癌症检测有关3。然而，只有不到十分之一的PDAC患者被诊断为预后良好，允许手术切除。尽管如此，少数可切除肿瘤患者也容易在 12 个月内复发4。
在过去的五十年中，手术技术、患者护理和治疗方式取得了显着进步 5,6。然而，手术切除的PDAC患者的5年生存率仅上升至17%。尽管如此，这仍然优于未切除的患者，后者几乎保持不变 （0.9%）4,7。化疗是唯一的替代PDAC治疗。然而，这种选择非常有限，因为绝大多数 PDAC 患者对化疗药物（如吉西他滨 7,8）表现出强烈的耐药性。其他药物，如厄洛替尼，仅适用于一小部分具有特定突变的PDAC患者，其中大多数表现出厄洛替尼耐药性9。在大多数PDAC患者中，与化疗相关的不良副作用是这种治疗的另一个缺点10。最近，有前途的策略表明，免疫检查点抑制剂 （ICI） 和小分子激酶抑制剂 （SMKI） 可有效治疗 PDAC，但对这些靶向治疗的持久反应仍然仅限于少数患者11,12。总体而言，PDAC特异性早期生物标志物的发现可以为早期诊断和治疗铺平新的途径。
PDAC由非浸润性胰管上皮增生引起的胰腺上皮内肿瘤（pancreatic intraepithelial tumors， PanIN）前体病变发展而来13,14。虽然 PanIN 的形成是由癌基因突变（如 KRAS）启动的，但进展为 PDAC 需要额外的遗传和表观遗传改变。据预测，PanIN通过不同阶段发展为侵入性PDAC大约需要10年13,15,16,17。这个时间范围提供了一个很好的机会，可以从早期PDAC诊断中受益。因此，已经进行了广泛的研究，以建立肿瘤异种移植动物模型和类器官培养物来研究PDAC的进展18,19,20,21。这些模型对于研究PDAC的侵袭阶段非常有用，尽管不是从早期PanIN阶段的过渡。因此，开发能够概括PanIN阶段早期进展的实验模型非常重要，以便能够发现早期检测生物标志物。
使用四种转录因子 OCT4、SOX2、KLF4 和 c-MYC （OSKM） 将体细胞重编程为诱导多能干细胞 （iPSC） 说明了细胞可塑性的程度22。癌细胞的可塑性已被充分证明，将人类癌细胞重编程为 iPSC 已成功用于将细胞重置为其原始细胞状态，从而消除癌症进展过程中积累的许多表观遗传损伤 23,24,25,26,27,28,29.因此，使用这种重编程策略来操纵癌细胞身份的可能性在治疗癌症方面具有巨大的希望30,31。事实上，我们之前已经证明，来自PDAC的iPSC的分化可以概括PDAC在早期PanIN阶段的进展32。通过鉴定PDAC早期至中期特异性的基因和通路，确定了可用于临床早期PDAC诊断的候选生物标志物32,33。然而，使用单个 iPSC 细胞系发现的生物标志物在大多数 PDAC 患者中的覆盖率有限32。从其他PDAC患者中生成iPSC细胞系的挑战已经阻止了发现更可靠生物标志物的能力。这是由于许多技术因素造成的，包括OSKM递送的异质性，因为只有一小部分人原代PDAC细胞包含所有四种因子并成功响应重编程。本文介绍了使用更有效、更一致的双慢病毒递送OSKM对原代PDAC细胞进行重编程的详细方案。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31350010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>330613</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Pituitary Extract (BPE)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13028014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BxPc3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1687</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>C8052-1MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen, Type I solution from rat tail</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>C3867</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Completed Defined K-SFM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;10744-019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS3516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning syringe filters</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS431231</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS430599</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day Impex&#160;Virkon Disinfectant Virucidal Tablets</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12328667</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>D8537</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10270-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene HD Transfection Reagent&#160;</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>&#160;E2312</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, Type B, 2% in H2O</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>G1393-100ML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Media (GMEM)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>G5154</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF Recombinant Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0311</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>100-18B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7)</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECA001-FP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMEF feeder cells&#160;</td>
			<td>iXcells Biotechnologies</td>
			<td>10MU-001-1V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte Serum Free Media (KSFM)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17005-042</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10829018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut serum Replacement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10828028</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030-024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HP 0.45 &#956;M syringe Filter Unit (Sterile)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>SLHP033RS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDG&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>187440</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)&#160;</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>H9268-5G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-CMV-K2M&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>21164</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF2-O2S&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>21162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>12260</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pWPT-GFP&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>12255</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium (ATCC modification)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1049101</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodym Pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11360-039</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringes for Single Use (60 mL)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15899152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Dihydrochloride)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reprogramming pancreatic ductal adenocarcinoma to pluripotency

使用转录因子生成诱导多能干细胞（iPSC）已经从几乎任何分化的细胞类型中实现，并被证明对研究和临床应用非常有价值。有趣的是，癌细胞（如胰腺导管腺癌 （PDAC））的 iPSC 重编程已被证明可以恢复侵袭性 PDAC 表型并覆盖癌症表观基因组。PDAC衍生的iPSCs的分化可以概括PDAC从其早期胰腺上皮内瘤变（PanIN）前体的进展，揭示PDAC进展早期发生的分子和细胞变化。因此，PDAC衍生的iPSC可用于对PDAC的早期阶段进行建模，以发现早期检测诊断标志物。这对于PDAC患者尤为重要，由于缺乏早期PanIN阶段的可靠生物标志物，他们通常在晚期转移阶段被诊断出来。然而，将癌细胞系（包括PDAC）重编程为多能性仍然具有挑战性、劳动密集型且不同细胞系之间差异很大。在这里，我们描述了一种更一致的方案，用于使用双反子慢病毒载体从各种人类PDAC细胞系中生成iPSC。所得的 iPSC 细胞系稳定，对重编程因子或诱导药物的外源表达没有依赖性。总体而言，该协议有助于生成广泛的PDAC衍生的iPSC，这对于发现更具特异性和代表性的PDAC病例的早期生物标志物至关重要。

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most fatal malignancies, and early diagnosis remains challenging due to the asymptomatic nature of the disease. The majority of PDAC patients are diagnosed at the advanced metastatic stage when very limited treatment options are available1,2. This is mainly due to the lack of reliable biomarkers for the earlier stages, such as those that could be conveniently detected as proteins released into the bloodstream.
PDAC can disseminate very early during its progression, and a better prognosis has been linked to early cancer detection when PDAC is localized in the pancreas3. However, less than a tenth of PDAC patients are diagnosed with a favorable prognosis, allowing for surgical resection. Nonetheless, those few with resectable tumors are also prone to tumor recurrence within 12 months4.
In the past five decades, remarkable improvements have been made in surgical techniques, patient care, and treatment modalities5,6. However, the 5-year survival rate in surgically resected PDAC patients has barely risen to 17%. Nonetheless, this is still better than that in non-resected patients, which has remained almost unchanged (0.9%)4,7. Chemotherapy is the only other alternative PDAC treatment. Yet, this option is very limited as the great majority of PDAC patients exhibit strong resistance to chemotherapy medications such as Gemcitabine7,8. Other drugs, such as Erlotinib, are only available to a small group of PDAC patients with specific mutations, most of whom show Erlotinib resistance9. The adverse side effects associated with chemotherapy in most PDAC patients are yet another disadvantage of this treatment10. Recently, promising strategies have shown that immune checkpoint inhibitors (ICIs) and small molecule kinase inhibitors (SMKIs) can be effective in treating PDAC, but durable responses to these targeted therapies remain limited to a minority of patients11,12. Overall, the discovery of PDAC-specific early biomarkers can pave new avenues for early diagnosis and treatment.
PDAC develops from pancreatic intraepithelial neoplasms (PanIN) precursor lesions that result from non-invasive pancreatic duct epithelial proliferations13,14. While the formation of PanIN is initiated by oncogene mutations such as KRAS, additional genetic and epigenetic alterations are required for the progression to PDAC. It has been projected that the progression of PanIN through the different stages into invasive PDAC takes about 10 years13,15,16,17. This timeframe provides a great opportunity to benefit from early PDAC diagnosis. Therefore, extensive research has been carried out to establish tumor xenograft animal models and organoid cultures to study PDAC progression18,19,20,21. These models have been very useful for studying the invasive stages of PDAC, although not the transition from the early PanIN phases. It is, therefore, important to develop experimental models that can recapitulate the early progression of PanIN stages to enable the discovery of early detection biomarkers.
Reprogramming somatic cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs) using the four transcription factors OCT4, SOX2, KLF4, and c-MYC (OSKM) has illustrated the extent of cellular plasticity22. Cancer cell plasticity has been well-documented, and reprogramming human cancer cells into iPSCs has been successfully used to reset cells to their original cellular state, removing many of the epigenetic insults that have accumulated during cancer progression23,24,25,26,27,28,29. The possibility of using this reprogramming strategy to manipulate cancer cell identity has, therefore, presented great promise in treating cancer30,31. Indeed, we have previously shown that the differentiation of iPSCs derived from PDACs can recapitulate PDAC progression through the early PanIN stages32. By identifying genes and pathways specific to the early-to-intermediate stages of PDAC, candidate biomarkers were identified that can be clinically used for early PDAC diagnosis32,33. However, the biomarkers discovered using a single iPSC line showed limited coverage in the majority of PDAC patients32. The challenges of generating iPSC lines from other PDAC patients have halted the ability to discover more reliable biomarkers. This is due to many technical factors, including the heterogeneity of OSKM delivery, as only a small portion of human primary PDAC cells contained all four factors and responded successfully to reprogramming. Here, a detailed protocol is presented for reprogramming primary PDAC cells using a more efficient and consistent dual lentiviral delivery of OSKM.

作者聚焦：将癌细胞重编程为 iPSC 以研究疾病进展和治疗靶点

将胰腺导管腺癌重编程为多能性

1 One of the most challenging aspects of studying PDAC<v>2 or pancreatic cancer is the availability 3 of an experimental model 4 that can recapitulate the progression 5 of PDAC from the early proline stages 6 to the aggressive state. 7 The other challenge is to experimentally capture 8 the plasticity and heterogeneity of PDAC. 9 So using PDAC IPS cells will help us tackle 10 some of these challenges 11 and expand our experimental tools to study this disease.12 We have established a robust protocol 13 to reprogram PDACs to iPS cells. 14 By generating more iPS lines from many more PDAC patients, 15 we can study the transition of pancreatic cancer 16 from early to advanced stages and see the commonalities 17 and differences between these lines. 18 This will help us discover early diagnostic markers 19 that cover more patients, 20 and generate drugs that target 21 the different states of the disease.22 The interesting question that came out of reprogramming 23 PDAC to iPS cells is what makes this cancer 24 so resistant to sulfate conversion compared to normal cells? 25 Is this due to specific genes or genetic mutations 26 that tell us something about cancer cell identity?

图 1 显示了来自 PDAC、BXPc3、H6C7 和 hFib 细胞的 iPSC 集落形态的代表性图像。PDAC-iPSC 菌落在重编程的第 25 天开始形成。在重编程的第 40 天鉴定出具有更成熟的 ESC 样形态的稳健 iPSC 集落（图 1）。同样，BxPc3-iPSCs的形成始于第23天，并在第35天变得更加成熟。H6C7-iPSC的形成与PDAC-iPSC相似，并在第45天开始建立。hFib-iPSC 集落在重编程...

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本方案描述了胰腺导管腺癌（PDAC）和正常胰腺导管上皮细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSC）。我们提供从制备慢病毒到建立稳定的iPSC细胞系的优化和详细的分步程序。

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

478 次观看.  The University of Edinburgh. 1 研究 PDAC 2 或胰腺癌最具挑战性的方面之一是3 实验模型 4 的可用性，该模型可以概括 PDAC 从早期脯氨酸阶段 6 到侵袭性状态的进展 5。7 另一个挑战是实验捕捉 8 PDAC 的可塑性和异质性。9 因此，使用 PDAC IPS 细胞将帮助我们应对 10 其中一些挑战 11 并扩展我们的研究这种疾病的实验工具。12 我们已经建立了一个强大的方案 13 来将 PDAC 重编?...