A.S e J.K gostariam de agradecer à Cancer Research UK e à OHSU pelo financiamento (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A A.S é apoiada por um prêmio de desenvolvimento de carreira da MRC (MR/N024028/1). A.A é financiado por uma bolsa de doutorado (Bolsa ref. 1078107040) da Cidade Rei Abdulaziz para Ciência e Tecnologia. J.K é financiado pelo MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) e Knight CEDAR grant (68182-933-000, 68182-939-000). Agradecemos ao Prof. Keisuke Kaji por gentilmente fornecer o vetor de reprogramação pSIN4-EF1a-O2S e pSIN4-CMV-K2M. Para fins de acesso aberto, o autor aplicou uma licença Creative Commons Attribution (CC BY) a qualquer versão do Manuscrito Aceito pelo Autor decorrente desta submissão.

Reprogramação de PDAC e células pancreáticas em células-tronco pluripotentes induzidas

Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.

Para facilitar o uso da reprogramação iPSC para estudar a progressão do câncer, um protocolo robusto foi estabelecido para reprogramação de células de câncer de pâncreas. A reprogramação de células cancerosas em pluripotência tem se mostrado muito desafiadora até o momento, pois poucos estudos conseguiram gerar iPSCs a partir de células cancerosas32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46 </s...

O adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) é uma das neoplasias malignas mais fatais, e o diagnóstico precoce permanece desafiador devido à natureza assintomática da doença. A maioria dos pacientes com ADP é diagnosticada na fase metastática avançada, quando opções de tratamento muito limitadas estão disponíveis 1,2. Isso se deve principalmente à falta de biomarcadores confiáveis para os estágios iniciais, como aqueles que poderiam ser convenientemente detectados como proteínas liberadas na corrente sanguínea.
O ADP pode disseminar-se muito precocemente durante sua progressão, e um melhor prognóstico tem sido associado à detecção precoce do câncer quando o ADP está localizado no pâncreas3. Entretanto, menos de um décimo dos pacientes com ADP são diagnosticados com prognóstico favorável, permitindo a ressecção cirúrgica. No entanto, aqueles poucos com tumores ressecáveis também são propensos à recorrência tumoral em 12meses4.
Nas últimas cinco décadas, melhorias notáveis foram feitas nas técnicas cirúrgicas, no atendimento ao paciente e nas modalidades de tratamento 5,6. No entanto, a taxa de sobrevida em 5 anos em pacientes com ADP ressecados cirurgicamente mal subiu para 17%. No entanto, este ainda é melhor do que em pacientes não ressecados, que permaneceu praticamente inalterado (0,9%)4,7. A quimioterapia é a única outra alternativa de tratamento para o ADP. No entanto, essa opção é muito limitada, pois a grande maioria dos pacientes com ADP apresenta forte resistência a medicamentos quimioterápicos como a Gencitabina 7,8. Outros fármacos, como o erlotinibe, estão disponíveis apenas para um pequeno grupo de pacientes com ADP com mutações específicas, a maioria dos quais apresenta resistência ao erlotinibe9. Os efeitos adversos associados à quimioterapia na maioria dos pacientes com ADP são outra desvantagem desse tratamento10. Recentemente, estratégias promissoras têm mostrado que inibidores de checkpoints imunes (ICIs) e inibidores de pequenas moléculas quinases (SMKIs) podem ser eficazes no tratamento de ADP, mas respostas duráveis a essas terapias-alvo permanecem limitadas a uma minoria de pacientes11,12. Em geral, a descoberta de biomarcadores precoces específicos para o PDAC pode pavimentar novos caminhos para o diagnóstico e tratamento precoces.
O ADP desenvolve-se a partir de lesões precursoras de neoplasias intraepiteliais pancreáticas (PanIN) que resultam de proliferações epiteliais não invasivas dos ductos pancreáticos13,14. Enquanto a formação de PanIN é iniciada por mutações oncogênicas como KRAS, alterações genéticas e epigenéticas adicionais são necessárias para a progressão para PDAC. Projeta-se que a progressão da NIPan através dos diferentes estágios para ADP invasiva leva cerca de 10 anos 13,15,16,17. Esse período oferece uma grande oportunidade de se beneficiar do diagnóstico precoce de ADP. Portanto, extensas pesquisas têm sido realizadas para estabelecer modelos animais de xenoenxerto tumoral e culturas organoides para estudar a progressão do ADP18,19,20,21. Esses modelos têm sido muito úteis para estudar os estágios invasivos do ADP, embora não a transição das fases iniciais da PanIN. Portanto, é importante desenvolver modelos experimentais que possam recapitular a progressão precoce dos estágios de PanIN para permitir a descoberta de biomarcadores de detecção precoce.
A reprogramação de células somáticas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando os quatro fatores de transcrição OCT4, SOX2, KLF4 e c-MYC (OSKM) ilustrou a extensão da plasticidade celular22. A plasticidade das células cancerosas tem sido bem documentada, e a reprogramação de células cancerosas humanas em iPSCs tem sido usada com sucesso para redefinir as células ao seu estado celular original, removendo muitos dos insultos epigenéticos que se acumularam durante a progressão do câncer 23,24,25,26,27,28,29. A possibilidade de utilizar essa estratégia de reprogramação para manipular a identidade das células cancerígenas tem, portanto, se apresentado como grande promessa no tratamento docâncer30,31. De fato, mostramos anteriormente que a diferenciação de iPSCs derivadas de PDACs pode recapitular a progressão da PDAC através dos estágios iniciais da PanIN32. Por meio da identificação de genes e vias específicas para os estágios iniciais a intermediários da ADP, foram identificados biomarcadores candidatos que podem ser utilizados clinicamente para o diagnóstico precoce da ADP32,33. No entanto, os biomarcadores descobertos usando uma única linhagem iPSC mostraram cobertura limitada na maioria dos pacientes com ADP32. Os desafios de gerar linhas iPSC de outros pacientes com ADP interromperam a capacidade de descobrir biomarcadores mais confiáveis. Isso se deve a muitos fatores técnicos, incluindo a heterogeneidade da liberação de OSKM, já que apenas uma pequena porção de células PDAC primárias humanas continha todos os quatro fatores e respondia com sucesso à reprogramação. Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para reprogramação de células PDAC primárias usando uma entrega lentiviral dupla mais eficiente e consistente de OSKM.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31350010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>330613</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Pituitary Extract (BPE)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13028014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BxPc3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1687</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>C8052-1MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen, Type I solution from rat tail</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>C3867</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Completed Defined K-SFM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;10744-019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS3516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning syringe filters</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS431231</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS430599</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day Impex&#160;Virkon Disinfectant Virucidal Tablets</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12328667</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>D8537</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10270-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene HD Transfection Reagent&#160;</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>&#160;E2312</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, Type B, 2% in H2O</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>G1393-100ML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Media (GMEM)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>G5154</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF Recombinant Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0311</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>100-18B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7)</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECA001-FP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMEF feeder cells&#160;</td>
			<td>iXcells Biotechnologies</td>
			<td>10MU-001-1V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte Serum Free Media (KSFM)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17005-042</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10829018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut serum Replacement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10828028</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030-024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HP 0.45 &#956;M syringe Filter Unit (Sterile)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>SLHP033RS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDG&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>187440</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)&#160;</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>H9268-5G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-CMV-K2M&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>21164</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF2-O2S&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>21162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>12260</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pWPT-GFP&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>12255</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium (ATCC modification)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1049101</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodym Pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11360-039</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringes for Single Use (60 mL)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15899152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Dihydrochloride)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reprogramming pancreatic ductal adenocarcinoma to pluripotency

A geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando fatores de transcrição tem sido obtida a partir de quase qualquer tipo celular diferenciado e tem se mostrado altamente valiosa para pesquisas e aplicações clínicas. Curiosamente, a reprogramação iPSC de células cancerosas, como o adenocarcinoma ductal pancreático (ADP), demonstrou reverter o fenótipo invasivo de ADP e anular o epigenoma do câncer. A diferenciação de iPSCs derivadas do PDAC pode recapitular a progressão do ADP a partir de seu precursor precoce da neoplasia intraepitelial pancreática (PanIN), revelando as mudanças moleculares e celulares que ocorrem precocemente durante a progressão do ADP. Portanto, iPSCs derivadas do PDAC podem ser usadas para modelar os estágios iniciais do PDAC para a descoberta de marcadores diagnósticos de detecção precoce. Isso é particularmente importante para pacientes com ADP, que geralmente são diagnosticados nos estágios metastáticos tardios devido à falta de biomarcadores confiáveis para os estágios iniciais da PanIN. No entanto, a reprogramação de linhagens de células cancerosas, incluindo PDAC, em pluripotência permanece desafiadora, trabalhosa e altamente variável entre diferentes linhagens. Aqui, descrevemos um protocolo mais consistente para gerar iPSCs a partir de várias linhagens celulares PDAC humanas usando vetores lentivirais bicistrônicos. As linhagens iPSC resultantes são estáveis, não mostrando dependência da expressão exógena de fatores reprogramadores ou drogas induzíveis. Em geral, esse protocolo facilita a geração de uma ampla gama de iPSCs derivadas do PDAC, o que é essencial para a descoberta precoce de biomarcadores mais específicos e representativos dos casos de ADP.

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most fatal malignancies, and early diagnosis remains challenging due to the asymptomatic nature of the disease. The majority of PDAC patients are diagnosed at the advanced metastatic stage when very limited treatment options are available1,2. This is mainly due to the lack of reliable biomarkers for the earlier stages, such as those that could be conveniently detected as proteins released into the bloodstream.
PDAC can disseminate very early during its progression, and a better prognosis has been linked to early cancer detection when PDAC is localized in the pancreas3. However, less than a tenth of PDAC patients are diagnosed with a favorable prognosis, allowing for surgical resection. Nonetheless, those few with resectable tumors are also prone to tumor recurrence within 12 months4.
In the past five decades, remarkable improvements have been made in surgical techniques, patient care, and treatment modalities5,6. However, the 5-year survival rate in surgically resected PDAC patients has barely risen to 17%. Nonetheless, this is still better than that in non-resected patients, which has remained almost unchanged (0.9%)4,7. Chemotherapy is the only other alternative PDAC treatment. Yet, this option is very limited as the great majority of PDAC patients exhibit strong resistance to chemotherapy medications such as Gemcitabine7,8. Other drugs, such as Erlotinib, are only available to a small group of PDAC patients with specific mutations, most of whom show Erlotinib resistance9. The adverse side effects associated with chemotherapy in most PDAC patients are yet another disadvantage of this treatment10. Recently, promising strategies have shown that immune checkpoint inhibitors (ICIs) and small molecule kinase inhibitors (SMKIs) can be effective in treating PDAC, but durable responses to these targeted therapies remain limited to a minority of patients11,12. Overall, the discovery of PDAC-specific early biomarkers can pave new avenues for early diagnosis and treatment.
PDAC develops from pancreatic intraepithelial neoplasms (PanIN) precursor lesions that result from non-invasive pancreatic duct epithelial proliferations13,14. While the formation of PanIN is initiated by oncogene mutations such as KRAS, additional genetic and epigenetic alterations are required for the progression to PDAC. It has been projected that the progression of PanIN through the different stages into invasive PDAC takes about 10 years13,15,16,17. This timeframe provides a great opportunity to benefit from early PDAC diagnosis. Therefore, extensive research has been carried out to establish tumor xenograft animal models and organoid cultures to study PDAC progression18,19,20,21. These models have been very useful for studying the invasive stages of PDAC, although not the transition from the early PanIN phases. It is, therefore, important to develop experimental models that can recapitulate the early progression of PanIN stages to enable the discovery of early detection biomarkers.
Reprogramming somatic cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs) using the four transcription factors OCT4, SOX2, KLF4, and c-MYC (OSKM) has illustrated the extent of cellular plasticity22. Cancer cell plasticity has been well-documented, and reprogramming human cancer cells into iPSCs has been successfully used to reset cells to their original cellular state, removing many of the epigenetic insults that have accumulated during cancer progression23,24,25,26,27,28,29. The possibility of using this reprogramming strategy to manipulate cancer cell identity has, therefore, presented great promise in treating cancer30,31. Indeed, we have previously shown that the differentiation of iPSCs derived from PDACs can recapitulate PDAC progression through the early PanIN stages32. By identifying genes and pathways specific to the early-to-intermediate stages of PDAC, candidate biomarkers were identified that can be clinically used for early PDAC diagnosis32,33. However, the biomarkers discovered using a single iPSC line showed limited coverage in the majority of PDAC patients32. The challenges of generating iPSC lines from other PDAC patients have halted the ability to discover more reliable biomarkers. This is due to many technical factors, including the heterogeneity of OSKM delivery, as only a small portion of human primary PDAC cells contained all four factors and responded successfully to reprogramming. Here, a detailed protocol is presented for reprogramming primary PDAC cells using a more efficient and consistent dual lentiviral delivery of OSKM.

Autor em destaque: Reprogramando células cancerígenas em iPSCs para estudar a progressão da doença e os alvos do tratamento

Reprogramação do Adenocarcinoma Ductal Pancreático para Pluripotência

1 One of the most challenging aspects of studying PDAC<v>2 or pancreatic cancer is the availability 3 of an experimental model 4 that can recapitulate the progression 5 of PDAC from the early proline stages 6 to the aggressive state. 7 The other challenge is to experimentally capture 8 the plasticity and heterogeneity of PDAC. 9 So using PDAC IPS cells will help us tackle 10 some of these challenges 11 and expand our experimental tools to study this disease.12 We have established a robust protocol 13 to reprogram PDACs to iPS cells. 14 By generating more iPS lines from many more PDAC patients, 15 we can study the transition of pancreatic cancer 16 from early to advanced stages and see the commonalities 17 and differences between these lines. 18 This will help us discover early diagnostic markers 19 that cover more patients, 20 and generate drugs that target 21 the different states of the disease.22 The interesting question that came out of reprogramming 23 PDAC to iPS cells is what makes this cancer 24 so resistant to sulfate conversion compared to normal cells? 25 Is this due to specific genes or genetic mutations 26 that tell us something about cancer cell identity?

Imagens representativas mostrando a morfologia de colônias iPSC derivadas de células PDAC, BXPc3, H6C7 e hFib são mostradas na Figura 1. As colônias PDAC-iPSC começaram a se formar no dia 25 de reprogramação. Colônias robustas de iPSC com morfologia ESC-like mais estabelecida foram identificadas no 40º dia de reprogramação (Figura 1). Da mesma forma, a formação de BxPc3-iPSCs começou no dia 23 e se tornou mais estab...

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O presente protocolo descreve a reprogramação do Adenocarcinoma Ductal Pancreático (ADP) e de células epiteliais ductais pancreáticas normais em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Fornecemos um procedimento otimizado e detalhado, passo a passo, desde a preparação do lentivírus até o estabelecimento de linhas iPSC estáveis.

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...

reprogramming-pancreatic-ductal-adenocarcinoma-to-pluripotency

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

507 visualizações.  The University of Edinburgh. 1 Um dos aspectos mais desafiadores do estudo do PDAC2 ou câncer de pâncreas é a disponibilidade 3 de um modelo experimental 4 que pode recapitular a progressão 5 do PDAC dos estágios iniciais de prolina 6 para o estado agressivo. 7 O outro desafio é capturar experimentalmente 8 a plasticidade e heterogeneidade do PDAC. 9 Portanto, o uso de células PDAC IPS nos ajudará a enfrentar 10 alguns desses desafios 11 e expandir nossa ferramentas experiment...