A.S. und J.K. danken Cancer Research UK und OHSU für die Finanzierung (CRUK-OHSU-Projektpreis C65925/A26986). A.S. wird durch einen MRC-Karriereentwicklungspreis (MR/N024028/1) unterstützt. A.A. wird durch ein Ph.D.-Stipendium (Scholarship Ref. 1078107040) der King Abdulaziz City for Science and Technology finanziert. J.K. wird durch den MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) und den Knight CEDAR Grant (68182-933-000, 68182-939-000) finanziert. Wir danken Prof. Keisuke Kaji für die freundliche Bereitstellung der Reprogrammierungsvektoren pSIN4-EF1a-O2S und pSIN4-CMV-K2M. Für die Zwecke des Open Access hat der Autor eine Creative Commons Attribution (CC BY)-Lizenz auf jede vom Autor akzeptierte Manuskriptversion angewendet, die sich aus dieser Einreichung ergibt.

Reprogrammierung von PDAC- und Pankreaszellen in induzierte pluripotente Stammzellen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Um die Verwendung der iPSC-Reprogrammierung zur Untersuchung des Krebsverlaufs zu erleichtern, wurde ein robustes Protokoll für die Reprogrammierung von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen entwickelt. Die Reprogrammierung von Krebszellen in Pluripotenz hat sich bisher als sehr schwierig erwiesen, da nur wenige Studien erfolgreich iPSCs aus Krebszellen erzeugt haben 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46 </...

Das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) ist eine der tödlichsten Malignome, und eine frühzeitige Diagnose bleibt aufgrund der asymptomatischen Natur der Krankheit eine Herausforderung. Die Mehrheit der PDAC-Patienten wird im fortgeschrittenen metastasierenden Stadium diagnostiziert, wenn nur sehr begrenzte Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung stehen 1,2. Dies ist hauptsächlich auf den Mangel an zuverlässigen Biomarkern für die früheren Stadien zurückzuführen, z. B. solche, die bequem als Proteine nachgewiesen werden könnten, die in den Blutkreislauf freigesetzt werden.
PDAC kann sich sehr früh während seines Fortschreitens ausbreiten, und eine bessere Prognose wurde mit der Krebsfrüherkennung in Verbindung gebracht, wenn PDAC in der Bauchspeicheldrüse lokalisiert ist3. Bei weniger als einem Zehntel der PDAC-Patienten wird jedoch eine günstige Prognose diagnostiziert, die eine chirurgische Resektion ermöglicht. Nichtsdestotrotz sind die wenigen mit resezierbaren Tumoren auch anfällig für ein Wiederauftreten des Tumors innerhalb von 12 Monaten4.
In den letzten fünf Jahrzehnten wurden bemerkenswerte Verbesserungen bei den Operationstechniken, der Patientenversorgung und den Behandlungsmodalitäten erzielt 5,6. Die 5-Jahres-Überlebensrate bei chirurgisch resezierten PDAC-Patienten ist jedoch kaum auf 17% gestiegen. Dies ist jedoch immer noch besser als bei nicht resezierten Patienten, die nahezu unverändert geblieben sind (0,9 %)4,7. Die Chemotherapie ist die einzige andere alternative PDAC-Behandlung. Diese Option ist jedoch sehr begrenzt, da die große Mehrheit der PDAC-Patienten eine starke Resistenz gegen Chemotherapeutika wie Gemcitabinaufweist 7,8. Andere Medikamente, wie Erlotinib, stehen nur einer kleinen Gruppe von PDAC-Patienten mit spezifischen Mutationen zur Verfügung, von denen die meisten eine Erlotinib-Resistenz aufweisen9. Die unerwünschten Nebenwirkungen, die mit der Chemotherapie bei den meisten PDAC-Patienten verbunden sind, sind ein weiterer Nachteil dieser Behandlung10. In jüngster Zeit haben vielversprechende Strategien gezeigt, dass Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs) und niedermolekulare Kinase-Inhibitoren (SMKIs) bei der Behandlung von PDAC wirksam sein können, aber ein dauerhaftes Ansprechen auf diese zielgerichteten Therapien bleibt auf eine Minderheit der Patienten beschränkt11,12. Insgesamt kann die Entdeckung von PDAC-spezifischen frühen Biomarkern neue Wege für eine frühzeitige Diagnose und Behandlung ebnen.
PDAC entwickelt sich aus Vorläuferläsionen von intraepithelialen Pankreasneoplasien (PanIN), die aus nicht-invasiven Epithelproliferationen des Pankreasgangs resultieren13,14. Während die Bildung von PanIN durch Onkogenmutationen wie KRAS initiiert wird, sind für die Progression zu PDAC zusätzliche genetische und epigenetische Veränderungen erforderlich. Es wurde prognostiziert, dass das Fortschreiten von PanIN durch die verschiedenen Stadien in die invasive PDAC etwa 10 Jahre dauert 13,15,16,17. Dieser Zeitrahmen bietet eine großartige Gelegenheit, von einer frühen PDAC-Diagnose zu profitieren. Daher wurden umfangreiche Forschungen durchgeführt, um Tumor-Xenotransplantat-Tiermodelle und Organoidkulturen zur Untersuchung der PDAC-Progression zu etablieren 18,19,20,21. Diese Modelle waren sehr nützlich für die Untersuchung der invasiven Stadien der PDAC, wenn auch nicht für den Übergang von den frühen PanIN-Phasen. Es ist daher wichtig, experimentelle Modelle zu entwickeln, die den frühen Verlauf von PanIN-Stadien rekapitulieren können, um die Entdeckung von Biomarkern zur Früherkennung zu ermöglichen.
Die Reprogrammierung somatischer Zellen in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung der vier Transkriptionsfaktoren OCT4, SOX2, KLF4 und c-MYC (OSKM) hat das Ausmaß der zellulären Plastizität veranschaulicht22. Die Plastizität von Krebszellen ist gut dokumentiert, und die Reprogrammierung menschlicher Krebszellen in iPSCs wurde erfolgreich eingesetzt, um Zellen in ihren ursprünglichen zellulären Zustand zurückzusetzen und viele der epigenetischen Beleidigungen zu entfernen, die sich während des Fortschreitens der Krebserkrankung angesammelt haben 23,24,25,26,27,28,29. Die Möglichkeit, diese Reprogrammierungsstrategie zur Manipulation der Krebszellidentität zu nutzen, ist daher bei der Behandlung von Krebs vielversprechend30,31. In der Tat haben wir bereits gezeigt, dass die Differenzierung von iPSCs, die von PDACs abgeleitet sind, die PDAC-Progression durch die frühen PanIN-Stadien rekapitulieren kann32. Durch die Identifizierung von Genen und Signalwegen, die für die frühen bis mittleren Stadien der PDAC spezifisch sind, wurden Kandidaten-Biomarker identifiziert, die klinisch für die frühe PDAC-Diagnose verwendet werden können32,33. Die Biomarker, die mit einer einzigen iPSC-Linie entdeckt wurden, zeigten jedoch bei der Mehrheit der PDAC-Patienten eine begrenzte Abdeckung32. Die Herausforderungen bei der Generierung von iPSC-Linien von anderen PDAC-Patienten haben die Entdeckung zuverlässigerer Biomarker verhindert. Dies ist auf viele technische Faktoren zurückzuführen, einschließlich der Heterogenität der OSKM-Verabreichung, da nur ein kleiner Teil der menschlichen primären PDAC-Zellen alle vier Faktoren enthielt und erfolgreich auf die Reprogrammierung reagierte. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Reprogrammierung primärer PDAC-Zellen unter Verwendung einer effizienteren und konsistenteren dualen lentiviralen Verabreichung von OSKM vorgestellt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31350010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>330613</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Pituitary Extract (BPE)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13028014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BxPc3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1687</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>C8052-1MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen, Type I solution from rat tail</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>C3867</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Completed Defined K-SFM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;10744-019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS3516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning syringe filters</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS431231</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS430599</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day Impex&#160;Virkon Disinfectant Virucidal Tablets</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12328667</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>D8537</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10270-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene HD Transfection Reagent&#160;</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>&#160;E2312</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, Type B, 2% in H2O</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>G1393-100ML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Media (GMEM)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>G5154</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF Recombinant Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0311</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>100-18B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7)</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECA001-FP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMEF feeder cells&#160;</td>
			<td>iXcells Biotechnologies</td>
			<td>10MU-001-1V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte Serum Free Media (KSFM)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17005-042</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10829018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut serum Replacement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10828028</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030-024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HP 0.45 &#956;M syringe Filter Unit (Sterile)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>SLHP033RS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDG&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>187440</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)&#160;</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>H9268-5G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-CMV-K2M&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>21164</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF2-O2S&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>21162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>12260</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pWPT-GFP&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>12255</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium (ATCC modification)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1049101</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodym Pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11360-039</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringes for Single Use (60 mL)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15899152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Dihydrochloride)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reprogramming pancreatic ductal adenocarcinoma to pluripotency

Die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung von Transkriptionsfaktoren wurde aus fast jedem differenzierten Zelltyp erreicht und hat sich für Forschung und klinische Anwendungen als sehr wertvoll erwiesen. Interessanterweise hat sich gezeigt, dass die iPSC-Reprogrammierung von Krebszellen, wie z. B. dem duktalen Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC), den invasiven PDAC-Phänotyp umkehrt und das Krebsepigenom außer Kraft setzt. Die Differenzierung von PDAC-abgeleiteten iPSCs kann die PDAC-Progression von ihrem frühen Pankreas-Intraepithelneoplasie-Vorläufer (PanIN) rekapitulieren und die molekularen und zellulären Veränderungen aufdecken, die früh während der PDAC-Progression auftreten. Daher können PDAC-abgeleitete iPSCs verwendet werden, um die frühesten Stadien von PDAC für die Entdeckung von diagnostischen Markern für die Früherkennung zu modellieren. Dies ist besonders wichtig für PDAC-Patienten, die in der Regel in den späten metastasierenden Stadien diagnostiziert werden, da es an zuverlässigen Biomarkern für die früheren PanIN-Stadien mangelt. Die Reprogrammierung von Krebszelllinien, einschließlich PDAC, in Pluripotenz bleibt jedoch eine Herausforderung, arbeitsintensiv und variiert stark zwischen verschiedenen Linien. Hier beschreiben wir ein konsistenteres Protokoll zur Erzeugung von iPSCs aus verschiedenen humanen PDAC-Zelllinien unter Verwendung von bicistronischen lentiviralen Vektoren. Die resultierenden iPSC-Linien sind stabil und zeigen keine Abhängigkeit von der exogenen Expression von Reprogrammierungsfaktoren oder induzierbaren Medikamenten. Insgesamt erleichtert dieses Protokoll die Generierung einer breiten Palette von PDAC-abgeleiteten iPSCs, was für die Entdeckung früher Biomarker, die spezifischer und repräsentativer für PDAC-Fälle sind, unerlässlich ist.

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most fatal malignancies, and early diagnosis remains challenging due to the asymptomatic nature of the disease. The majority of PDAC patients are diagnosed at the advanced metastatic stage when very limited treatment options are available1,2. This is mainly due to the lack of reliable biomarkers for the earlier stages, such as those that could be conveniently detected as proteins released into the bloodstream.
PDAC can disseminate very early during its progression, and a better prognosis has been linked to early cancer detection when PDAC is localized in the pancreas3. However, less than a tenth of PDAC patients are diagnosed with a favorable prognosis, allowing for surgical resection. Nonetheless, those few with resectable tumors are also prone to tumor recurrence within 12 months4.
In the past five decades, remarkable improvements have been made in surgical techniques, patient care, and treatment modalities5,6. However, the 5-year survival rate in surgically resected PDAC patients has barely risen to 17%. Nonetheless, this is still better than that in non-resected patients, which has remained almost unchanged (0.9%)4,7. Chemotherapy is the only other alternative PDAC treatment. Yet, this option is very limited as the great majority of PDAC patients exhibit strong resistance to chemotherapy medications such as Gemcitabine7,8. Other drugs, such as Erlotinib, are only available to a small group of PDAC patients with specific mutations, most of whom show Erlotinib resistance9. The adverse side effects associated with chemotherapy in most PDAC patients are yet another disadvantage of this treatment10. Recently, promising strategies have shown that immune checkpoint inhibitors (ICIs) and small molecule kinase inhibitors (SMKIs) can be effective in treating PDAC, but durable responses to these targeted therapies remain limited to a minority of patients11,12. Overall, the discovery of PDAC-specific early biomarkers can pave new avenues for early diagnosis and treatment.
PDAC develops from pancreatic intraepithelial neoplasms (PanIN) precursor lesions that result from non-invasive pancreatic duct epithelial proliferations13,14. While the formation of PanIN is initiated by oncogene mutations such as KRAS, additional genetic and epigenetic alterations are required for the progression to PDAC. It has been projected that the progression of PanIN through the different stages into invasive PDAC takes about 10 years13,15,16,17. This timeframe provides a great opportunity to benefit from early PDAC diagnosis. Therefore, extensive research has been carried out to establish tumor xenograft animal models and organoid cultures to study PDAC progression18,19,20,21. These models have been very useful for studying the invasive stages of PDAC, although not the transition from the early PanIN phases. It is, therefore, important to develop experimental models that can recapitulate the early progression of PanIN stages to enable the discovery of early detection biomarkers.
Reprogramming somatic cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs) using the four transcription factors OCT4, SOX2, KLF4, and c-MYC (OSKM) has illustrated the extent of cellular plasticity22. Cancer cell plasticity has been well-documented, and reprogramming human cancer cells into iPSCs has been successfully used to reset cells to their original cellular state, removing many of the epigenetic insults that have accumulated during cancer progression23,24,25,26,27,28,29. The possibility of using this reprogramming strategy to manipulate cancer cell identity has, therefore, presented great promise in treating cancer30,31. Indeed, we have previously shown that the differentiation of iPSCs derived from PDACs can recapitulate PDAC progression through the early PanIN stages32. By identifying genes and pathways specific to the early-to-intermediate stages of PDAC, candidate biomarkers were identified that can be clinically used for early PDAC diagnosis32,33. However, the biomarkers discovered using a single iPSC line showed limited coverage in the majority of PDAC patients32. The challenges of generating iPSC lines from other PDAC patients have halted the ability to discover more reliable biomarkers. This is due to many technical factors, including the heterogeneity of OSKM delivery, as only a small portion of human primary PDAC cells contained all four factors and responded successfully to reprogramming. Here, a detailed protocol is presented for reprogramming primary PDAC cells using a more efficient and consistent dual lentiviral delivery of OSKM.

Autor im Rampenlicht: Reprogrammierung von Krebszellen zu iPSCs zur Untersuchung des Krankheitsverlaufs und der Behandlungsziele

Umprogrammierung des duktalen Adenokarzinoms der Bauchspeicheldrüse zur Pluripotenz

1 One of the most challenging aspects of studying PDAC<v>2 or pancreatic cancer is the availability 3 of an experimental model 4 that can recapitulate the progression 5 of PDAC from the early proline stages 6 to the aggressive state. 7 The other challenge is to experimentally capture 8 the plasticity and heterogeneity of PDAC. 9 So using PDAC IPS cells will help us tackle 10 some of these challenges 11 and expand our experimental tools to study this disease.12 We have established a robust protocol 13 to reprogram PDACs to iPS cells. 14 By generating more iPS lines from many more PDAC patients, 15 we can study the transition of pancreatic cancer 16 from early to advanced stages and see the commonalities 17 and differences between these lines. 18 This will help us discover early diagnostic markers 19 that cover more patients, 20 and generate drugs that target 21 the different states of the disease.22 The interesting question that came out of reprogramming 23 PDAC to iPS cells is what makes this cancer 24 so resistant to sulfate conversion compared to normal cells? 25 Is this due to specific genes or genetic mutations 26 that tell us something about cancer cell identity?

Repräsentative Bilder, die die Morphologie von iPSC-Kolonien zeigen, die von PDAC-, BXPc3-, H6C7- und hFib-Zellen abgeleitet sind, sind in Abbildung 1 dargestellt. PDAC-iPSC-Kolonien begannen sich am 25. Tag der Reprogrammierung zu bilden. Robuste iPSC-Kolonien mit einer etablierteren ESC-ähnlichen Morphologie wurden am Tag 40 der Reprogrammierung identifiziert (Abbildung 1). In ähnlicher Weise begann die Bildung von BxPc3-iPS...

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Das vorliegende Protokoll beschreibt die Reprogrammierung von duktalen Adenokarzinomen der Bauchspeicheldrüse (PDAC) und normalen duktalen Epithelzellen der Bauchspeicheldrüse in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs). Wir bieten ein optimiertes und detailliertes Schritt-für-Schritt-Verfahren, von der Vorbereitung des Lentivirus bis zur Etablierung stabiler iPSC-Linien.

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...

reprogramming-pancreatic-ductal-adenocarcinoma-to-pluripotency

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

510 Aufrufe.  The University of Edinburgh. 1 Einer der schwierigsten Aspekte bei der Untersuchung von PDAC2 oder Bauchspeicheldrüsenkrebs ist die Verfügbarkeit 3 eines experimentellen Modells 4, das die Progression 5 von PDAC von den frühen Prolinstadien 6 bis zum aggressiven Zustand rekapitulieren kann. 7 Die andere Herausforderung besteht darin, 8 die Plastizität und Heterogenität von PDAC experimentell zu erfassen. 9 Die Verwendung von PDAC IPS-Zellen wird uns also helfen, 10 einige dieser ...

Serie: Autor im Rampenlicht: Reprogrammierung von Krebszellen zu iPSCs zur Untersuchung des Krankheitsverlaufs und der Behandlungsziele

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has proved highly valuable for research and clinical applications. Interestingly, iPSC reprogramming of cancer cells, such as pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), has been shown to revert the invasive PDAC phenotype and override the cancer epigenome. The differentiation of PDAC-derived iPSCs can recapitulate PDAC progression from its early pancreatic intraepithelial neoplasia (PanIN) precursor, revealing the molecular and cellular changes that occur early during PDAC progression. Therefore, PDAC-derived iPSCs can be used to model the earliest stages of PDAC for the discovery of early-detection diagnostic markers. This is particularly important for PDAC patients, who are typically diagnosed at the late metastatic stages due to a lack of reliable biomarkers for the earlier PanIN stages. However, reprogramming cancer cell lines, including PDAC, into pluripotency remains challenging, labor-intensive, and highly variable between different lines. Here, we describe a more consistent protocol for generating iPSCs from various human PDAC cell lines using bicistronic lentiviral vectors. The resulting iPSC lines are stable, showing no dependence on the exogenous expression of reprogramming factors or inducible drugs. Overall, this protocol facilitates the generation of a wide range of PDAC-derived iPSCs, which is essential for discovering early biomarkers that are more specific and representative of PDAC cases.

The present protocol describes the reprogramming of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (PDAC) and normal pancreatic ductal epithelial cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs). We provide an optimized and detailed, step-by-step procedure, from preparing lentivirus to establishing stable iPSC lines.

Forschung

Krebsforschung

Lentivirus Preparation and Reprogramming Transduction for Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Cells

1 2 To begin, see the HEK 293T cells<v>3 24 hours before transfection 4 in a 15 centimeter dish containing GMEN. 5 Incubate the cells at 37 degrees Celsius 6 and 5%carbon dioxide 7 until they reach 40 to 50%confluency. 8 Label three 15 milliliter plastic tubes 9 with the appropriate lentivirus name.10 Add 1.710 milliliters of reduced serum medium 11 and 90 microliters of transfection reagent to each tube. 12 Mix the contents by vortexing 13 before incubating the tubes at room temperature. 14 After five minutes, add the packaging vector mixture 15 to the transfection medium and vortex.16 Then add 7.5 micrograms of reprogramming vector 17 and the pWPT-GFP control 18 to the respective transfection mixture. 19 Vortex the tubes for two seconds 20 before incubating for 15 minutes at room temperature. 21 To transfect the 293T cells with each lentivirus, 22 dropwise, add a transfection DNA mixture into the dish.23 Incubate the transfected cells at 37 degrees Celsius 24 and 5%carbon dioxide. 25 After 14 to 16 hours, 26 replace the medium with 30 milliliters 27 of fresh 293T medium 28 and continue incubation for 60 to 72 hours. 29 Observe the cells daily 30 and check transfection efficiency.31 Next, transfer the virus transfection culture 32 into 15 milliliter tubes 33 and spin down at 1, 932 G for 10 minutes 34 at four degrees Celsius. 35 Filter the lentiviral supernatant 36 using a 0.45 micron syringe filter 37 into a new 50 milliliter tube. 38 One day before lentivirus transduction, 39 prepare two wells of a 6-well plate 40 containing 100, 000 PDAC cells per well.41 Prepare two 15 milliliter tubes 42 with two milliliters of pre-warmed PDAC medium. 43 In the first tube, 44 add 12 milliliters of reprogramming lentivirus. 45 Then add 12 microliters of polybrene 46 and mix by pipetting.47 To the second tube, 48 add two microliters of polybrene. 49 Now carefully remove the medium from each well 50 of a 6-well plate 51 and wash once with PBS at room temperature. 52 Add the reprogramming infection medium 53 from tube one to the first well.54 Add the mixture from tube two to the second well. 55 Incubate the cells overnight at 37 degrees Celsius 56 with 5%carbon dioxide and 5%oxygen. 57 The next day, replace the medium 58 from both wells with fresh PDAC medium 59 and continue incubation 60 for up to 48 hours as demonstrated.

Lentivirus-Präparation und Reprogrammierungstransduktion für duktale Adenokarzinomzellen der Bauchspeicheldrüse

Preparation of iMEF Feeder Cells and Reprogramming Transduction for Induced Pluripotent Stem Cells

1 To begin, coat the 6-well plate<v>2 with two milliliters of 0.2%gelatin solution per well. 3 Incubate the plate at 37 degrees Celsius 4 and 5%carbon dioxide for 30 minutes. 5 Next, drop-wise add iMEFs into a 15 milliliter tube 6 containing 10 milliliters 7 of pre-warmed human fibroblast medium, 8 and mix by gently inverting the tube.9 Centrifuge the cell suspension at 309 G for three minutes. 10 And remove the supernatant before re-suspending the pellet 11 in 12 milliliters of human fibroblast medium. 12 Place two milliliters of the cell suspension 13 into each well of the gelatin-coated six well plate.14 And incubate overnight at 37 degrees Celsius 15 and 5%carbon dioxide. 16 Discard the medium from the lentivirus-infected 17 and non-infected PDAC, and wash the cells twice with PBS. 18 Then add 500 microliters of trypsin to dissociate the cells.19 And incubate at 37 degrees Celsius 20 with 5%carbon dioxide and 5%oxygen 21 for 15 minutes. 22 Centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes. 23 And re-suspend the pellet in one milliliter of PDAC medium.24 Wash the iMEF plate with PDAC medium. 25 Then add 50, 000 lentivirus-infected PDAC cells 26 per well in five wells of iMEF plate, and incubate overnight 27 as demonstrated previously. 28 After preparing the reprogramming medium, 29 add 100 microliters of basic fibroblasts growth factor 30 to 100 milliliters of reprogramming medium.31 The next day, wash the cells growing on iMEF feeders twice 32 with pre-warmed reprogramming media. 33 Then add two milliliters of media to each well, 34 and incubate overnight at 37 degrees Celsius 35 with 5%carbon dioxide and 3%oxygen. 36 After passing the IPSC pool five times, 37 observe the robust colonies 38 maintaining ESC-like morphology.39 The PDAC, BxPc3, 40 H6c7, and human fibroblast 41 showed different days of reprogramming 42 to form a mature ESC-like morphology. 43 Clonal IPSC lines were established 44 from each reprogramming of PDAC, 45 BxPc3, H6c7, 46 and human fibroblast cells. 47 All established IPSC lines stained positive 48 for TRA-160, confirming their reprogramming to pluripotency.