A.S et J.K tiennent à remercier Cancer Research UK et OHSU pour leur financement (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S est soutenu par une bourse de développement de carrière du CMR (MR/N024028/1). Les AA sont financés par une bourse de doctorat (bourse réf. 1078107040) de la Cité du roi Abdulaziz pour la science et la technologie. J.K est financé par la subvention de nouveau chercheur MRF (GCNCR1042A) et la subvention Knight CEDAR (68182-933-000, 68182-939-000). Nous remercions le professeur Keisuke Kaji d’avoir aimablement fourni les vecteurs de reprogrammation pSIN4-EF1a-O2S et pSIN4-CMV-K2M. Aux fins du libre accès, l’auteur a appliqué une licence Creative Commons Attribution (CC BY) à toute version du manuscrit accepté par l’auteur découlant de cette soumission.

Reprogrammation des cellules PDAC et pancréatiques en cellules souches pluripotentes induites

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Pour faciliter l’utilisation de la reprogrammation des iPSC pour étudier la progression du cancer, un protocole robuste a été établi pour la reprogrammation des cellules cancéreuses du pancréas. La reprogrammation des cellules cancéreuses en pluripotence s’est avérée très difficile jusqu’à présent, car seules quelques études ont réussi à générer des iPSC à partir de cellules cancéreuses 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46<sup c...

L’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est l’une des tumeurs malignes les plus mortelles, et le diagnostic précoce reste difficile en raison de la nature asymptomatique de la maladie. La majorité des patients atteints de PDAC sont diagnostiqués au stade métastatique avancé lorsque les options de traitement disponibles sont très limitées 1,2. Cela est principalement dû au manque de biomarqueurs fiables pour les stades précoces, tels que ceux qui pourraient être facilement détectés comme des protéines libérées dans la circulation sanguine.
Le PDAC peut se disséminer très tôt au cours de sa progression, et un meilleur pronostic a été associé à la détection précoce du cancer lorsque le PDAC est localisé dans le pancréas3. Cependant, moins d’un dixième des patients atteints de PDAC reçoivent un diagnostic de pronostic favorable, ce qui permet une résection chirurgicale. Néanmoins, les quelques personnes atteintes de tumeurs résécables sont également sujettes à une récidive tumorale dans les 12 mois4.
Au cours des cinq dernières décennies, des améliorations remarquables ont été apportées aux techniques chirurgicales, aux soins aux patients et aux modalités de traitement 5,6. Cependant, le taux de survie à 5 ans chez les patients PDAC réséqués chirurgicalement a à peine atteint 17 %. Néanmoins, cela reste meilleur que celui des patients non réséqués, qui est resté pratiquement inchangé (0,9 %)4,7. La chimiothérapie est le seul autre traitement alternatif du PDAC. Cependant, cette option est très limitée car la grande majorité des patients atteints de PDAC présentent une forte résistance aux médicaments de chimiothérapie tels que la gemcitabine 7,8. D’autres médicaments, comme l’erlotinib, ne sont disponibles que pour un petit groupe de patients atteints de PDAC présentant des mutations spécifiques, dont la plupart présentent une résistance à l’erlotinib9. Les effets secondaires indésirables associés à la chimiothérapie chez la plupart des patients PDAC sont un autre inconvénient de ce traitement10. Récemment, des stratégies prometteuses ont montré que les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (ICI) et les inhibiteurs de kinases à petites molécules (SMKI) peuvent être efficaces dans le traitement du PDAC, mais les réponses durables à ces thérapies ciblées restent limitées à une minorité de patients11,12. Dans l’ensemble, la découverte de biomarqueurs précoces spécifiques au PDAC peut ouvrir de nouvelles voies pour un diagnostic et un traitement précoces.
Le PDAC se développe à partir de lésions précurseurs de néoplasmes intra-épithéliales pancréatiques (PanIN) qui résultent de proliférations épithéliales non invasives du canal pancréatique13,14. Bien que la formation de PanIN soit initiée par des mutations oncogènes telles que KRAS, des altérations génétiques et épigénétiques supplémentaires sont nécessaires pour la progression vers le PDAC. Il a été prévu que la progression du PanIN à travers les différentes étapes vers le PDAC invasif prend environ 10 ans 13,15,16,17. Ce délai offre une excellente occasion de bénéficier d’un diagnostic précoce de l’ACPE. Par conséquent, des recherches approfondies ont été menées pour établir des modèles animaux de xénogreffes tumorales et des cultures d’organoïdes afin d’étudier la progression du PDAC 18,19,20,21. Ces modèles ont été très utiles pour étudier les stades invasifs du PDAC, mais pas la transition des premières phases de PanIN. Il est donc important de développer des modèles expérimentaux capables de récapituler la progression précoce des stades PanIN pour permettre la découverte de biomarqueurs de détection précoce.
La reprogrammation des cellules somatiques en cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à l’aide des quatre facteurs de transcription OCT4, SOX2, KLF4 et c-MYC (OSKM) a illustré l’étendue de la plasticité cellulaire22. La plasticité des cellules cancéreuses a été bien documentée, et la reprogrammation des cellules cancéreuses humaines en iPSC a été utilisée avec succès pour réinitialiser les cellules à leur état cellulaire d’origine, éliminant ainsi de nombreuses agressions épigénétiques qui se sont accumulées au cours de la progression du cancer 23,24,25,26,27,28,29. La possibilité d’utiliser cette stratégie de reprogrammation pour manipuler l’identité des cellules cancéreuses s’est donc révélée très prometteuse dans le traitement du cancer30,31. En effet, nous avons précédemment montré que la différenciation des iPSC dérivées des PDAC peut récapituler la progression du PDAC à travers les premiers stades PanIN32. En identifiant les gènes et les voies spécifiques aux stades précoces et intermédiaires du PDAC, des biomarqueurs candidats ont été identifiés qui peuvent être utilisés cliniquement pour le diagnostic précoce du PDAC32,33. Cependant, les biomarqueurs découverts à l’aide d’une seule lignée d’iPSC ont montré une couverture limitée chez la majorité des patients atteints de PDAC32. Les défis liés à la génération de lignées iPSC à partir d’autres patients PDAC ont mis fin à la capacité de découvrir des biomarqueurs plus fiables. Cela est dû à de nombreux facteurs techniques, notamment l’hétérogénéité de l’administration d’OSKM, car seule une petite partie des cellules primaires humaines du PDAC contenait les quatre facteurs et répondait avec succès à la reprogrammation. Ici, un protocole détaillé est présenté pour reprogrammer les cellules primaires PDAC en utilisant une double administration lentivirale plus efficace et cohérente d’OSKM.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31350010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>330613</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Pituitary Extract (BPE)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13028014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BxPc3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1687</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>C8052-1MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen, Type I solution from rat tail</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>C3867</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Completed Defined K-SFM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;10744-019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS3516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning syringe filters</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS431231</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS430599</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day Impex&#160;Virkon Disinfectant Virucidal Tablets</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12328667</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>D8537</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10270-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene HD Transfection Reagent&#160;</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>&#160;E2312</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, Type B, 2% in H2O</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>G1393-100ML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Media (GMEM)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>G5154</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF Recombinant Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0311</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>100-18B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7)</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECA001-FP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMEF feeder cells&#160;</td>
			<td>iXcells Biotechnologies</td>
			<td>10MU-001-1V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte Serum Free Media (KSFM)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17005-042</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10829018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut serum Replacement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10828028</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030-024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HP 0.45 &#956;M syringe Filter Unit (Sterile)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>SLHP033RS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDG&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>187440</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)&#160;</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>H9268-5G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-CMV-K2M&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>21164</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF2-O2S&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>21162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>12260</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pWPT-GFP&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>12255</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium (ATCC modification)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1049101</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodym Pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11360-039</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringes for Single Use (60 mL)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15899152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Dihydrochloride)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reprogramming pancreatic ductal adenocarcinoma to pluripotency

La génération de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) à l’aide de facteurs de transcription a été réalisée à partir de presque tous les types de cellules différenciées et s’est avérée très précieuse pour la recherche et les applications cliniques. Il est intéressant de noter que la reprogrammation des cellules cancéreuses par iPSC, comme l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC), inverse le phénotype invasif du PDAC et remplace l’épigénome du cancer. La différenciation des iPSC dérivées du PDAC peut récapituler la progression du PDAC à partir de son précurseur précoce de la néoplasie intra-épithéliale pancréatique (PanIN), révélant les changements moléculaires et cellulaires qui se produisent tôt au cours de la progression du PDAC. Par conséquent, les iPSC dérivées du PDAC peuvent être utilisées pour modéliser les premiers stades du PDAC pour la découverte de marqueurs diagnostiques de détection précoce. Ceci est particulièrement important pour les patients atteints de PDAC, qui sont généralement diagnostiqués aux stades métastatiques tardifs en raison d’un manque de biomarqueurs fiables pour les stades antérieurs de PanIN. Cependant, la reprogrammation des lignées cellulaires cancéreuses, y compris le PDAC, en pluripotence reste difficile, laborieuse et très variable entre les différentes lignées. Ici, nous décrivons un protocole plus cohérent pour générer des iPSC à partir de diverses lignées cellulaires PDAC humaines à l’aide de vecteurs lentiviraux bicistroniques. Les lignées iPSC résultantes sont stables, ne montrant aucune dépendance à l’expression exogène de facteurs de reprogrammation ou de médicaments inductibles. Dans l’ensemble, ce protocole facilite la génération d’un large éventail d’iPSC dérivées du PDAC, ce qui est essentiel pour découvrir des biomarqueurs précoces plus spécifiques et représentatifs des cas de PDAC.

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most fatal malignancies, and early diagnosis remains challenging due to the asymptomatic nature of the disease. The majority of PDAC patients are diagnosed at the advanced metastatic stage when very limited treatment options are available1,2. This is mainly due to the lack of reliable biomarkers for the earlier stages, such as those that could be conveniently detected as proteins released into the bloodstream.
PDAC can disseminate very early during its progression, and a better prognosis has been linked to early cancer detection when PDAC is localized in the pancreas3. However, less than a tenth of PDAC patients are diagnosed with a favorable prognosis, allowing for surgical resection. Nonetheless, those few with resectable tumors are also prone to tumor recurrence within 12 months4.
In the past five decades, remarkable improvements have been made in surgical techniques, patient care, and treatment modalities5,6. However, the 5-year survival rate in surgically resected PDAC patients has barely risen to 17%. Nonetheless, this is still better than that in non-resected patients, which has remained almost unchanged (0.9%)4,7. Chemotherapy is the only other alternative PDAC treatment. Yet, this option is very limited as the great majority of PDAC patients exhibit strong resistance to chemotherapy medications such as Gemcitabine7,8. Other drugs, such as Erlotinib, are only available to a small group of PDAC patients with specific mutations, most of whom show Erlotinib resistance9. The adverse side effects associated with chemotherapy in most PDAC patients are yet another disadvantage of this treatment10. Recently, promising strategies have shown that immune checkpoint inhibitors (ICIs) and small molecule kinase inhibitors (SMKIs) can be effective in treating PDAC, but durable responses to these targeted therapies remain limited to a minority of patients11,12. Overall, the discovery of PDAC-specific early biomarkers can pave new avenues for early diagnosis and treatment.
PDAC develops from pancreatic intraepithelial neoplasms (PanIN) precursor lesions that result from non-invasive pancreatic duct epithelial proliferations13,14. While the formation of PanIN is initiated by oncogene mutations such as KRAS, additional genetic and epigenetic alterations are required for the progression to PDAC. It has been projected that the progression of PanIN through the different stages into invasive PDAC takes about 10 years13,15,16,17. This timeframe provides a great opportunity to benefit from early PDAC diagnosis. Therefore, extensive research has been carried out to establish tumor xenograft animal models and organoid cultures to study PDAC progression18,19,20,21. These models have been very useful for studying the invasive stages of PDAC, although not the transition from the early PanIN phases. It is, therefore, important to develop experimental models that can recapitulate the early progression of PanIN stages to enable the discovery of early detection biomarkers.
Reprogramming somatic cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs) using the four transcription factors OCT4, SOX2, KLF4, and c-MYC (OSKM) has illustrated the extent of cellular plasticity22. Cancer cell plasticity has been well-documented, and reprogramming human cancer cells into iPSCs has been successfully used to reset cells to their original cellular state, removing many of the epigenetic insults that have accumulated during cancer progression23,24,25,26,27,28,29. The possibility of using this reprogramming strategy to manipulate cancer cell identity has, therefore, presented great promise in treating cancer30,31. Indeed, we have previously shown that the differentiation of iPSCs derived from PDACs can recapitulate PDAC progression through the early PanIN stages32. By identifying genes and pathways specific to the early-to-intermediate stages of PDAC, candidate biomarkers were identified that can be clinically used for early PDAC diagnosis32,33. However, the biomarkers discovered using a single iPSC line showed limited coverage in the majority of PDAC patients32. The challenges of generating iPSC lines from other PDAC patients have halted the ability to discover more reliable biomarkers. This is due to many technical factors, including the heterogeneity of OSKM delivery, as only a small portion of human primary PDAC cells contained all four factors and responded successfully to reprogramming. Here, a detailed protocol is presented for reprogramming primary PDAC cells using a more efficient and consistent dual lentiviral delivery of OSKM.

Pleins feux sur l’auteur : Reprogrammation des cellules cancéreuses en iPSC pour étudier la progression de la maladie et les cibles de traitement

Reprogrammation de l’adénocarcinome canalaire pancréatique à la pluripotence

Des images représentatives montrant la morphologie des colonies d’iPSC dérivées de cellules PDAC, BXPc3, H6C7 et hFib sont présentées à la figure 1. Les colonies PDAC-iPSC ont commencé à se former au jour 25 de la reprogrammation. Des colonies de CSPi robustes avec une morphologie plus établie de type ESC ont été identifiées au jour 40 de la reprogrammation (Figure 1). De même, la formation des CSPi BxPc3 a commenc...

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Le présent protocole décrit la reprogrammation de l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) et des cellules épithéliales canalaires pancréatiques normales en cellules souches pluripotentes induites (CSPi). Nous fournissons une procédure optimisée et détaillée, étape par étape, de la préparation du lentivirus à l’établissement de lignées iPSC stables.

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...

reprogramming-pancreatic-ductal-adenocarcinoma-to-pluripotency

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

540 vues.  The University of Edinburgh. 1 L’un des aspects les plus difficiles de l’étude du PDAC2 ou cancer du pancréas est la disponibilité 3 d’un modèle expérimental 4 qui peut récapituler la progression 5 du PDAC des premiers stades de la proline 6 à l’état agressif. 7 L’autre défi est de capturer expérimentalement 8 la plasticité et l’hétérogénéité du PDAC. 9 Ainsi, l’utilisation de cellules PDAC IPS nous aidera à relever 10 certains de ces défis 11 et à él...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Reprogrammation des cellules cancéreuses en iPSC pour étudier la progression de la maladie et les cibles de traitement

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has proved highly valuable for research and clinical applications. Interestingly, iPSC reprogramming of cancer cells, such as pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), has been shown to revert the invasive PDAC phenotype and override the cancer epigenome. The differentiation of PDAC-derived iPSCs can recapitulate PDAC progression from its early pancreatic intraepithelial neoplasia (PanIN) precursor, revealing the molecular and cellular changes that occur early during PDAC progression. Therefore, PDAC-derived iPSCs can be used to model the earliest stages of PDAC for the discovery of early-detection diagnostic markers. This is particularly important for PDAC patients, who are typically diagnosed at the late metastatic stages due to a lack of reliable biomarkers for the earlier PanIN stages. However, reprogramming cancer cell lines, including PDAC, into pluripotency remains challenging, labor-intensive, and highly variable between different lines. Here, we describe a more consistent protocol for generating iPSCs from various human PDAC cell lines using bicistronic lentiviral vectors. The resulting iPSC lines are stable, showing no dependence on the exogenous expression of reprogramming factors or inducible drugs. Overall, this protocol facilitates the generation of a wide range of PDAC-derived iPSCs, which is essential for discovering early biomarkers that are more specific and representative of PDAC cases.

The present protocol describes the reprogramming of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (PDAC) and normal pancreatic ductal epithelial cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs). We provide an optimized and detailed, step-by-step procedure, from preparing lentivirus to establishing stable iPSC lines.