Para começar, semeie 200 microlitros de volume de 10.000 células de carcinoma hepatocelular em uma placa de 96 poços com DMEM e 10% FBS. Incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada sob 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, substituir os meios de cultura e tratar as células com concentrações variáveis de peróxido de hidrogênio e menadiona.
Dissolva cinco miligramas de DHE em um mililitro de DMSO. Para a solução de trabalho, diluir uma alíquota de 100 micromoles com meio DMEM pré-aquecido para uma concentração de 10 micromoles. Vórtice a solução do corante de trabalho por 5 a 10 segundos para garantir a mistura adequada.
Agora remova o meio de teste de cada poço antes de colocar as células do carcinoma. Em seguida, lave suavemente cada poço com PBS. Pipetar 100 microlitros da solução do corante de trabalho em cada poço.
Incubar a placa a 37 graus Celsius durante 30 minutos. Remova o meio que contém DHE de cada poço. Use uma pipeta multicanal para lavar cada poço três vezes com PBS.
Agora, pipetar 200 microlitros de PBS contendo corante nuclear Hoechst 33342 em cada poço. Após a incubação, transfira a placa para uma plataforma de triagem de alto conteúdo. Inicie o software de triagem de alto conteúdo Cellomics CX7.
Calibre a plataforma de imagem de acordo com as especificações do fabricante. Abra os parâmetros do sistema específicos para a marca da placa no banco de dados do instrumento. Em seguida, coloque cuidadosamente a placa com as amostras no estágio aquecido do sistema de imagem.
Certifique-se de que a placa está bem posicionada e na orientação correta. Em seguida, pressione suavemente a microplaca para garantir que ela fique encostada no palco. Quando a placa estiver posicionada corretamente, pressione e mantenha pressionada a tecla Control.
Em seguida, clique em Controle e OK para abrir a caixa de diálogo Carga/Descarga de placa. Para selecionar os parâmetros de imagem, abra o modo de ativação de destino na interface Cellomics BioApplications. Criar um novo protocolo para aquisição de dados dual-channel compatível com coloração nuclear e sonda de fluorescência DHE.
Em seguida, especifique os objetivos necessários para a aquisição da imagem e, em seguida, escolha a ampliação apropriada. Agora especifique o tempo de exposição, a flexão da câmera e o intervalo z-stack. Uma vez definidos os parâmetros de imagem, identifique o objeto de rastreamento primário de interesse usando os diferentes algoritmos do instrumento.
Depois de segmentar o objeto identificado, valide o objeto primário com base nos parâmetros específicos de tamanho, forma e intensidade exclusivos para cada tipo de célula. Defina a região de interesse ao redor do objeto e defina um círculo de 20 micrômetros em torno dele. Clique na guia Caracterização da população e, em seguida, defina o limite de varredura para 1000 células por poço com um mínimo de 10 objetos por campo.
Agora clique em Launch View para escanear cada placa de poço. Em seguida, inicie o software de análise de visualização e exporte os parâmetros de dados quantitativos em um formato CSV para análise adicional. A exposição ao peróxido resultou em um incremento estatisticamente significativo da fluorescência induzida por ROS em todas as linhagens celulares de forma dose-dependente.
Com menadiona, as células JHH-4 apresentaram incremento dose-dependente na intensidade fluorescente. Entretanto, a diferença significativa na fluorescência foi observada apenas em concentrações mais elevadas nas outras duas linhagens celulares.
