Para começar, instale câmaras de 0,5 mililitro no respirômetro O2K de acordo com as instruções do fabricante. Ligue o instrumento e conecte-o ao software fornecido para aquisição de dados. Lave as câmaras três vezes com água deionizada.
Substitua a água por 0,54 mililitros de MiR05 e feche totalmente as rolhas. Depois de remover o excesso de tampão, levante as rolhas para permitir que o oxigênio ambiente se equilibre com o oxigênio da câmara. Coloque uma coluna no campo magnético de um separador de células magnéticas e lave a coluna com três mililitros de RP5.
Ressuspenda a célula mononuclear do sangue periférico recém-isolada, ou pellet PBMC, em 80 microlitros de RP5, juntamente com 20 microlitros de microesferas anti-CD14. Incube as células por 15 minutos a quatro graus Celsius. Diluir as células com um mililitro de RP5 antes de carregar a suspensão na coluna.
Colete células não marcadas que fluem para um tubo cônico de 15 mililitros rotulado como fluxo através de um"Lave a coluna três vezes com três mililitros de RP5 para coletar o fluxo através do líquido. Remova cuidadosamente a coluna do campo magnético e coloque-a em um novo tubo cônico de 15 mililitros. Depois de adicionar cinco mililitros de RP5, empurre o êmbolo para dentro da coluna para coletar o conteúdo no tubo.
Depois de centrifugar o fluxo através de um tubo, repita as etapas de isolamento usando microesferas anti-CD3 com as células para obter linfócitos T. Centrifugue as células contendo células T CD3 positivas e monócitos CD14 positivos. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em um mililitro de RP5.
Usando um hemocitômetro, determine a concentração celular. Adicione 2,5 milhões de monócitos e 5 milhões de células T em novos tubos de centrífuga. Pellet as células e ressuspendê-las em 20 microlitros de MiR05.
Instale os sensores fluorescentes e inicie um experimento file na unidade de respirômetro O2K. Usando os sensores fluorescentes LED verdes, com o conjunto de filtros AMR, ajuste o ganho do fluorômetro e a intensidade para 1000. Defina o volume da câmara para 0,5 mililitros e ajuste o layout para ver o fluxo de oxigênio e a fluorescência TMRM.
Quando o fluxo de oxigênio estiver estável, execute a calibração do oxigênio do ar de acordo com o protocolo do fabricante. Feche as rolhas para selar a câmara. Usando uma seringa Hamilton, injete 2,5 microlitros de éster metílico de tetrametilrodamina 0,05 milimolar, ou TMRM, quatro vezes.
Calibre o sensor de fluxo com um sinal fluorescente para cada injeção representando 0, 0,25, 0,5, 0,75 e 1,0 micromolar de TMRM. Injete 20 microlitros de MiR05 para executar o experimento em branco. Depois que o fluxo de oxigênio se estabilizar, selecione e rotule o fluxo de oxigênio e o sinal TMRM como pré-célula.
Injete 20 microlitros da suspensão celular contendo as células e meça por cerca de 10 minutos. Em seguida, selecione e rotule o fluxo de oxigênio e os sinais TMRM como células. Em seguida, repita as etapas para cada tratamento sequencialmente e rotule o fluxo de oxigênio e o sinal TMRM adequadamente.
Quando o fluxo de oxigênio estiver estável, injete um microlitro de antimicina A 1,25 milimolar para inibir a respiração mitocondrial. Para cada experimento em branco, defina a concentração de TMRM pré-amostra como um para calcular a proporção de fundo. Calcule a diminuição proporcional subsequente no TMRM e a proporção média de fundo de todos os experimentos em branco.
Em seguida, multiplique o TMRM pré-amostra do experimento de amostra pela proporção média de fundo para cada injeção de cada experimento de amostra. Subtraia o histórico do experimento aos valores de TMRM medidos da amostra. Em seguida, subtraia o potencial de membrana mitocondrial corrigido pelo fundo FCCP de cada injeção.
Para normalizar a diminuição impulsionada pelo ADP, defina o potencial de membrana mais alto e mais baixo como 100% e 0%, respectivamente, e ajuste os dados em um modelo de regressão de ajuste não linear. Estudos comparativos sobre alterações impulsionadas por ADP em células T e monócitos de voluntários saudáveis mostraram que os monócitos exibiram maior perda do potencial de membrana mitocondrial em comparação com as células T. A metade da concentração inibitória máxima de ADP no potencial de membrana mitocondrial foi menor para os monócitos em comparação com as células T.
Um aumento típico de resposta à dose nas taxas de consumo de oxigênio com ADP não foi detectado em nenhum dos tipos de célula.
